膝沟藻毒素GTX2，3单克隆抗体的制备及酶联免疫快速检测法的建立

发布时间：2017-08-15 06:06

  本文关键词：膝沟藻毒素GTX2，3单克隆抗体的制备及酶联免疫快速检测法的建立

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【摘要】：膝沟藻毒素2,3(gonyautoxin 23,GTX2,3)是一类氨基甲酸酯类麻痹性贝类毒素(PSP),具有分布广、毒性强、对人体危害严重等特点,是我国南方沿海染毒贝类和有毒赤潮藻的主要毒素之一,严重威胁广东沿海海域贝类的食用安全。本研究主要采用乙二醛作为偶联剂将小分子GTX2,3分别与载体蛋白BSA和KLH进行蛋白偶联,制备完全免疫抗原和检测抗原,通过完全抗原的偶联鉴定、动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞株克隆化培养技术及小鼠体内诱生法制备抗GTX2,3单克隆抗体,并对反应条件进行优化,建立了GTX2,3间接竞争ELISA酶联免疫快速检测法。实验结果如下:(1)本实验采用乙二醛作为偶联剂将小分子GTX2,3分别与载体蛋白BSA和KLH进行蛋白偶联制备完全免疫抗原和检测抗原,并通过BCA蛋白浓度测定、紫外扫描、变性SDS-PAGE凝胶电泳和抗原免疫原性等鉴定方法,证明成功制备了具有较强免疫原性的GTX2,3完全抗原,其中免疫抗原的蛋白浓度为8.52mg/mL、分子偶联比为15:1,检测抗原的蛋白浓度为5.72 mg/mL,通过间接ELISA检测免疫4次后的小鼠血清效价达到1:51200。(2)分别采取足垫及腹腔注射免疫、颈背部皮下多点免疫、腹腔注射免疫和快速免疫佐剂肌肉注射免疫共四种不同免疫方法免疫6-8周龄健康的雌性BALB/c小鼠,最高的小鼠抗血清效价分别为1:25600、1:51200、1:102400和1:51200。摘取不同免疫方案中抗血清效价最高的小鼠脾细胞与复苏的SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。采用细胞融合技术及有限稀释克隆技术成功筛选出3株能稳定分泌抗GTX2,3的阳性杂交瘤细胞株2-2H11、3-2F2和3-3C9,杂交瘤细胞上清液效价分别为1:128、1:64和1:256,经小鼠单抗亚类试剂盒鉴定,抗体亚类均为IgG1。并通过小鼠体内诱生腹水法、辛酸-硫酸铵法(CA-AS)和Protein A株亲和层析纯化法、BCA蛋白浓度测定、间接ELISA法和单抗亚类鉴定,最终选择抗GTX2,3单克隆抗体亚类为IgG1、抗体效价高达1:102400、抗体的亲和常数为1.05×108 L/mol的具有良好的特异性的GTX2,3-3-3C9腹水单抗,用于后续的GTX2,3间接竞争ELISA方法的建立。(3)利用抗GTX2,3单克隆抗体3-3C9建立的检测GTX2,3间接竞争ELISA方法的线性回归方程为y=-14.821x+98.544,相关系数R2=0.9942,灵敏度(IC50)为1.653μg/mL,线性检测范围(IC20-IC80)为0.277-9.852μg/m L,检测限为0.136μg/m L。用本实验所建立的用GTX2,3-ic-ELISA计算的香港牡蛎的加标回收率为90.05%-113.7%,波纹巴非蛤的为94.55%-106.0%;用HPLC计算的香港牡蛎和波纹巴非蛤的加标回收率分别为97.98%-103.3%和96.90%-101.9%。两者的加标回收率均在80%-120%范围内,说明所建立的GTX2,3-ic-ELISA在一定浓度范围内具有与HPLC法一样的准确度。
【关键词】：膝沟藻毒素GTX2 3 完全抗原 单克隆抗体 间接竞争ELISA
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392;R446.6
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 英文缩写词表11-13
• 1 绪论13-21
• 1.1 研究背景13-19
• 1.1.1 PSP的来源13
• 1.1.2 PSP的生物链传递13-14
• 1.1.3 PSP的化学结构、分类及毒性14-15
• 1.1.4 PSP的理化性质15
• 1.1.5 PSP的提取技术15-16
• 1.1.6 PSP的检测方法16-19
• 1.2 研究目的与意义19
• 1.3 研究方法与技术路线19-21
• 1.3.1 研究方法19-20
• 1.3.2 技术路线20-21
• 2 GTX2,3 完全抗原的制备及鉴定21-33
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 主要仪器和试剂21
• 2.1.2 实验动物21
• 2.1.3 主要试剂的配制21-23
• 2.2 实验方法23-26
• 2.2.1 GTX2,3 完全抗原的制备23-24
• 2.2.2 完全抗原偶联效果的鉴定24-25
• 2.2.3 完全抗原免疫原性的鉴定25-26
• 2.3 结果与分析26-29
• 2.3.1 BCA法检测完全抗原的蛋白浓度26
• 2.3.2 GTX2,3 完全抗原全波段紫外扫描鉴定26-27
• 2.3.3 免疫抗原GTX2,3-BSA变性SDS-PAGE凝胶电泳鉴定27-28
• 2.3.4 抗GTX2,3 小鼠免疫血清的效价测定28-29
• 2.3.5 检测抗原GTX2,3-Gly-KLH最佳包被浓度的确定29
• 2.4 讨论29-31
• 2.4.1 GTX2,3 与载体蛋白的偶联29-30
• 2.4.2 完全抗原偶联效果的分析30-31
• 2.5 小结31-33
• 3 GTX2,3 单克隆抗体的制备及鉴定33-56
• 3.1 实验材料33-36
• 3.1.1 主要仪器和试剂33-34
• 3.1.2 主要试剂的配制34-36
• 3.2 实验方法36-45
• 3.2.1 动物免疫36-37
• 3.2.2 小鼠免疫血清的收集和检测37-38
• 3.2.3 抗GTX2,3 杂交瘤细胞株的建立38-42
• 3.2.4 小鼠体内诱生腹水法制备抗GTX2,3 腹水型单克隆抗体42-43
• 3.2.5 抗GTX2,3 腹水型单克隆抗体的纯化43-44
• 3.2.6 抗GTX2,3 腹水型单克隆抗体的鉴定44-45
• 3.3 结果与分析45-51
• 3.3.1 4种免疫方案免疫小鼠抗血清的效价测定45-46
• 3.3.2 细胞融合及有限稀释法克隆筛选46-48
• 3.3.3 GTX2,3 细胞上清液抗体效价的测定48
• 3.3.4 GTX2,3 阳性杂交瘤细胞株细胞上清液单抗亚类的鉴定48
• 3.3.5 GTX2,3 腹水单抗蛋白浓度及抗体效价测定48-49
• 3.3.6 GTX2,3 腹水单抗亚类鉴定49
• 3.3.7 GTX2,3 腹水单抗纯化效果及IgG类蛋白轻、重链分子量的测定49-50
• 3.3.8 GTX2,3 腹水单抗抗体亲和常数的测定50
• 3.3.9 GTX2,3 腹水单抗特异性的鉴定50-51
• 3.4 讨论51-54
• 3.4.1 不同免疫方法的分析51-52
• 3.4.2 影响细胞融合的主要因素52-53
• 3.4.3 腹水单抗的纯化53-54
• 3.5 小结54-56
• 4 GTX2,3 间接竞争ELISA检测方法的建立56-71
• 4.1 实验材料56
• 4.1.1 主要仪器和试剂56
• 4.1.2 单克隆抗体56
• 4.1.3 主要试剂的配制56
• 4.2 实验方法56-59
• 4.2.1 GTX2,3-KLH与抗GTX2,3 单克隆抗体最佳工作浓度的确定56
• 4.2.2 检测抗原GTX2,3-Gly-KLH最佳包被条件的选择56-57
• 4.2.3 最佳封闭条件的确定57
• 4.2.4 最佳封闭时间的选择57
• 4.2.5 抗GTX2,3 单克隆抗体的最佳反应时间的确定57
• 4.2.6 GAM-HRP酶标二抗最佳稀释浓度的选择57
• 4.2.7 GAM-HRP酶标二抗的最佳反应时间的确定57
• 4.2.8 TMB底物最佳反应时间的选择57-58
• 4.2.9 膝沟藻毒素GTX2,3 间接竞争ELISA竞争抑制标准曲线的绘制58
• 4.2.10 GTX2,3间接竞争ELISA 检测限的确定58
• 4.2.11样品前处理及模拟样品的检测58-59
• 4.3 结果与分析59-67
• 4.3.1 棋盘滴定法确定抗原抗体的最佳工作浓度59
• 4.3.2 最佳包被条件的选择59-60
• 4.3.3 最佳封闭条件的确定60
• 4.3.4 最佳封闭时间的选择60-61
• 4.3.5 单抗最佳反应时间的确定61-62
• 4.3.6 酶标二抗最佳稀释浓度的选择62-63
• 4.3.7 酶标二抗最佳反应时间的确定63-64
• 4.3.8 底物最佳作用时间的选择64-65
• 4.3.9 优化后的GTX2,3 间接竞争ELISA检测方法的反应条件65
• 4.3.10 GTX2,3 间接竞争ELISA标准曲线的绘制及检测限的确定65-66
• 4.3.11 GTX2,3 间接竞争ELISA准确度的测定66-67
• 4.4 讨论67-69
• 4.4.1 GTX2,3- ic-ELISA检测方法的建立67-68
• 4.4.2 最佳封闭条件的确定68
• 4.4.3 影响显色反应的因素68-69
• 4.5 小结69-71
• 5 结论与展望71-73
• 5.1 结论71-72
• 5.2 展望72-73
• 参考文献73-77
• 致谢77-78
• 作者简介78-79
• 导师简介79-80
• 导师简介80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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2 王文军,张学林,王东红,王文华;毛细管离子分析方法测定湖水中主要无机阴离子含量[J];环境化学;2001年03期

3 刘智勇;计融;;各国贝类水产品中麻痹性贝类毒素限量标准的比对[J];中国热带医学;2006年01期

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1 黄爱君;腹泻性贝类毒素细胞检测方法的研究[D];华南理工大学;2010年

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本文编号：676576