KNDC1过表达对人脐静脉血管内皮细胞衰老的作用及其机制研究

发布时间：2017-08-15 19:18

  本文关键词：KNDC1过表达对人脐静脉血管内皮细胞衰老的作用及其机制研究

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【摘要】：背景和目的：衰老是机体随着年龄的增长,其机体生理功能逐渐下降的过程,是发病率日益增长的年龄相关性疾病,如老年痴呆、心血管疾病的独立危险因素。这些疾病大多与血管功能老化有关,而随着老龄人口的不断增加,正日益成为社会和家庭的沉重负担。目前控制血管功能老化已经成为控制年龄相关性疾病的重要环节。血管老化最初被定义为血管脆性增加,舒缩能力降低。事实上血管功能紊乱是上述疾病共同的发病基础,早衰病的患者大多数都合并有动脉粥样硬化疾病。值得注意的是,多个和衰老有关的基因已经被证实和血管功能障碍有关,如FOXO1A、FOXO3A、sirt-1等。这说明血管衰老、机体老化及年龄相关性疾病之间存在本质的联系。血管作为运输通道,为组织提供营养、氧气及生物活性物质,并且带走组织产生的废物和二氧化碳。动脉血管是由内膜、中膜及外膜构成,其中动脉内膜是横亘在血流和血管之间的薄层组织,由内皮细胞及基膜构成。内皮细胞不仅在胚胎组织血管生成过程中起重要作用,而且在诸如损伤修复、缺血适应、肿瘤生成等过程中同样发挥重要作用。除此之外,内皮细胞可以感知血流变化,并且通过产生血管活性物质如一氧化氮(NO)、血管紧张Ⅱ,调节血管平滑肌细胞。因此,内皮细胞在维持内环境稳定方面发挥了关键作用。生理状态下,内皮细胞在体内几乎处于静止状态,生理状态下只有约0.1%的内皮细胞保持增殖状态。然而,当内皮细胞暴露于病理刺激后,可以被激活并进入分裂状态,最终将引起端粒缩短,细胞进入衰老期后,内皮细胞呈现出衰老相关的形态和功能改变,细胞变得扁平,体积增大,细胞多倍体数目增加。除此之外,内皮细胞还出现β半乳糖苷酶活性增强、细胞停滞在细胞周期的GO/GI期、衰老相关的蛋白表达阳性等；同时,血管内皮细胞衰老过程中,分泌的各种生物学活性因子也在发生变化,如NO的合成下降、炎性因子合成增加、粘附因子表达增多等。这些变化都将造成内皮细胞功能障碍,最终导致动脉粥样硬化的发生。目前研究表明氧化应激是导致细胞衰老的经典机制之一,ROS可导致DNA严重损伤,细胞基因表达的变化,继而细胞进入不可逆的凋亡和衰老过程中。p53/p21是一种重要的细胞衰老相关的信号转导通路。此外,P53可以调节细胞内活性氧的水平,p53对ROS的调控主要依赖于p53对其下游氧化还原相关靶基因的调控。KNDC1 (kinase non-catalytic C-lobe domain (KIND) containing 1,KNDC1)位于人类染色体10q263位点,是2006年新发现的基因,其功能与Ras鸟苷酸交换因子活性(Ras guanyl-nucleotide exchange factor activity)和蛋白丝/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)相关。目前哺乳动物中发现4种含有KIND域的蛋白：Spir2、PTPN13 (nonreceptor-type protein tyrosine phosphatase 13)、 FRMPD2 (FERM and PDZ-domain-containing 2)和KNDC1。KNDC1存在于树突、鸟苷酸交换因子复合物、以及神经元细胞体中,参与了大脑颗粒细胞分化,具有蛋白磷酸酶活性,并具有调节催化活性。在许多信号转导通路的蛋白间分子识别和功能调控中扮演着重要角色。既往研究表明KNDC1的RasGEF舌性通过JNK1和／或ERK,经由Ras-Raf-MAP激酶通路诱导MAP2的磷酸化,MAP2磷酸化后与微管结合的活性增加,可以促进神经细胞树突的长度增加,研究还发现抑制或敲低KNDC1的表达可以促进培养中的小脑颗粒细胞和海马神经元的树突生长,这表明其作为一种信号分子在发育过程中调控或者抑制神经元树突生长。但是其对血管内皮细胞的调节功能及作用机制国内外尚未见研究报道。我们既往的研究已经证明了KNDC1 mRNA转录及KNDC1蛋白表达在衰老的HUVECs有所增加。而且通过敲低KNDC1的表达后,内皮细胞的衰老得以延迟。然而,尚需要更多的研究证实KNDC1在内皮细胞衰老中的作用和机制。因此本研究将通过内皮细胞KNDC1过表达方法,确认其在内皮细胞衰老中的作用,并进一步对其作用机制进行探讨。方法：1.细胞培养：实验所用人脐静脉内皮细胞由新生儿脐带分离获得,脐带由北京某三甲医院产科提供,细胞分离后,加入含20%胎牛血清的ECM培养液,放入5% CO2培养箱内中37℃培养。首次获得的细胞为第0代,第一次传代后获得的细胞为第一代。培养液2-3天更换一次,当细胞增殖到80-90%融合度时,使用0.125%胰蛋白酶进行1：3传代。根据我们前期实验结果,选择第6-10代的细胞进行实验,并培养在六孔板中。2.腺病毒转染：KNDC1腺病毒交由Santa Cruz Biotechnology公司合成。选择第6代内皮细胞转染KNDC1腺病毒,同时设置空白对照组及阴性对照组(空白腺病毒),并培养24小时。分组情况为：(1)C,空白对照组；(2)A,阴性对照组,转染空白腺病毒；(3)K30/60/90,实验组,分别转染剂量为30/60/90 epu/cell的KNDC1腺病毒。3.mRNA表达分析：内皮细胞经上述处理后,用TRIZOI试剂提取每组细胞总RNA,使用SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒,通过qPCR检测内皮细胞的KNDC1的mRNA的表达。在检测过程中以GAPDH作为内对照。并且以GAPDH为内参,使用CT值计量mRNA相对表达量。CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。因此每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数存在负性关系,即起始拷贝数越多,CT值越小。使用Sequence Detector System software version 2.1进行数据分析,CT值自动转化为RNA的倍数变化值,计算方式为(实验组与对照组)倍数变化=2-(△△CT),where一(△△CT)=-(△CTtrt-△CTcontrol)=-[(CtTarget-CtGAPDH)trt-(CtTarget—CtGAPDH)control].4.β-半乳糖苷酶染色：内皮细胞被转染不同浓度的KNDCl月泉病毒后培养48小时,吸除细胞培养基,并以PBS冲洗细胞面两遍,使用固定液室温固定15min。吸除细胞固定液,用PBS洗涤细胞3次。加入染色工作液,37℃孵育24小时。普通光学显微镜下观察并拍照：胞浆呈蓝色者为阳性细胞,表示细胞处于衰老状态,计算出的阳性细胞总数占总细胞数的百分率,实验重复3次。5.Westemblot检测衰老相关蛋白：采用Westemblot法检测人脐静脉内皮细胞KNDC1、SIRT1、p53.p-p53、Erk、p-Erk、p21、p27、eNOS蛋白的表达。6.抗氧化酶活性检测：分光光度法检测各组脐静脉内皮细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)含量。7.统计学分析：所有实验数据以均数±标准差(Mean士SD)表示。两组间比较采用t检验；三组比较采用单因素方差分析比较,如差别存在统计学意义,采用SNK方法进行组间两两比较。P0.05,认为具有显著统计学意义。结果：1.在本研究中,第六代的人脐静脉内皮细胞已经呈现出有别于前期传代细胞的衰老特征,细胞变得扁平,体积增大,增殖能力降低。为了进一步研究KNDC1是否与细胞衰老有关,通过qPCR及western blot的方法,我们检测了各代龄细胞间KNDC1转录水平和表达水平的变化,发现随着脐静脉内皮细胞的衰老,KNDC1转录水平和表达水平逐渐增加,并且具有统计学差异。2.使用携带KNDC1的腺病毒转染第六代脐静脉内皮细胞后,KNDC1的表达水平显著上升。KNDC1 mRNA转录水平增加了239-344%,同样的KNDC1蛋白质表达也显著增加,并且有明显的剂量依赖性。3.和对照组相比,转染KNDC1腺病毒后的脐静脉内皮细胞SA-β-Gal染色阳性率显著上升。随着KNDC1腺病毒转染剂量从30至90 epu/cell,内皮细胞SA-β-gal染色阳性率也大致呈剂量依赖性增加,各组间染色阳性率分别为6.2±1.3%(C),8.2±0.3%(A),26.3±2.5%(K30),62.9±2.8%(K60)和55.3±5.8%(K90)。K60和K90两组染色阳性率无明显差异,因此在以后的研究中实验组KNDC1腺病毒转染量均为60 epu/cell。4.为了探究KNDC1高表达是否影响内皮细胞MAPK信号转导通路,我们检测各组细胞间MAPK相关蛋白的表达,发现磷酸化erk表达量明显下降,差异具有统计学意义。5.作为一种重要的细胞周期抑制因子,实验组磷酸化p53较阴性对照组明显增加(113.5±9.0 vs.244.3±19.5),差异具有统计学意义,提示p53信号通路在KNDC1相关性细胞衰老中发挥了重要作用。6.本课题组既往研究表明]SNDC1敲低可以通过减少细胞内活性氧含量而延缓细胞衰老,在本研究中,我们确认了这种变化,实验组抗氧化酶含量较对照组下降(SOD:98.0±3.0 vs.83.3±5.1 and Gpx:95.0±6.0 vs.83.0±5.6),差异有统计学意义。结论：1.本实验成功的构建了携带KNDC1基因的重组腺病毒载体,并运用重组腺病毒载体成功转人脐静脉内皮细胞,且转染率较高。2.KNDC1腺病毒转染内皮细胞后β半乳糖苷酶染色阳性,证明KNDC1在内皮细胞衰老途径中发挥了重要作用。3.KNDC1腺病毒转染内皮细胞后抗氧化酶表达降低,证实了氧化应激与KNDC1相关性内皮细胞衰老形成有着直接的联系。4. KNDC1可以激活p53/p21信号转导通路,导致内皮细胞衰老。并且p53和ROS间可能存在一个反馈环。较强或持续压力刺激下p53发挥促氧化作用,而ROS的过量产生又可进一步激活p53,从而形成p53-ROS正反馈环,这一正反馈环在推动衰老发生的过程中发挥重要作用。通过实验结果我们发现KNDC1调控这一正反馈环而影响细胞早衰。5. KNDC1可通过MAPK途径,抑制erk的磷酸化,抑制内皮细胞增殖,从而间接发挥致衰老的作用。
【关键词】：人脐静脉内皮细胞 衰老 KNDC1 p53 Erk 氧化应激
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R339.38
【目录】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-22
• 材料与方法22-36
• 2.1 主要试剂及配制22-23
• 2.2 主要仪器23-24
• 2.3 HUVECs培养24-28
• 2.4 腺病毒转染28
• 2.5 SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色28-29
• 2.6 RT-PCR29-31
• 2.7 western blot31-34
• 2.8 细胞抗氧化指标(SOD、GPx活性)的测定34-35
• 2.9 统计分析35-36
• 结果36-45
• 3.1 内皮细胞的鉴定36-37
• 3.2 KNDC1高表达对内皮细胞衰老的影响及机制37-45
• 讨论45-53
• 4.1 内皮细胞的分离鉴定45-46
• 4.2 KNDC1高表达对内皮细胞衰老的影响及机制46-53
• 结论53-54
• 参考文献54-59
• 附录59-61
• 英文缩略词表59-60
• 发表文章60
• 参与的科研项目60-61
• 致谢61-62

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本文编号：679857