幽门螺杆菌Tipα蛋白经激活NLRP3炎性小体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18

发布时间：2017-08-16 22:08

  本文关键词：幽门螺杆菌Tipα蛋白经激活NLRP3炎性小体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18

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【摘要】：目的幽门螺杆菌感染引起的胃部炎症性变化是产生胃部疾病的主要原因,而幽门螺杆菌Tipα蛋白是新近发现引起炎症反应的主要致炎蛋白,NLRP3炎性小体是炎症反应的重要调节因子,本实验以佛波酯(PMA)诱导分化的THP-1巨噬细胞为模型,初步探讨NLRP3炎性小体在Tipα蛋白诱导炎性细胞因子分泌中的作用。方法:1.Tipα蛋白的表达与鉴定:Genbank查获Tipα全基因序列,PCR法获取去除信号肽后的Tipα基因序列,构建p ET-30a(+)/Tipα重组载体;测序鉴定。将p ET-30a(+)/Tipα重组载体转化至E.coli BL21(DE3)表达菌内,诱导表达、Ni-NTA纯化、去内毒素处理,Western blot鉴定,BCA法测定Tipα重组蛋白浓度。2.初步探索Tipα蛋白对靶细胞的致炎作用:用Tipα蛋白刺激巨噬细胞,ELISA检测其促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-18的分泌水平。3.验证Tipα蛋白通过NF-κB/NLRP3信号通路产生炎症反应,生成促炎细胞因子:分别用NF-κB通路阻断剂PDTC和ROS清除剂NAC预处理细胞,ELISA检测预处理前后Tipα诱导细胞分泌促炎细胞因子水平差异,Western blot检测NLRP3和Caspase-1分子的表达水平差异。结果:1.双酶切及测序鉴定p ET-30a(+)/Tipα重组载体插入Tipα基因序列与Genbank登录序列符合率为100%;载体可在E.coli BL21(DE3)表达菌内有效表达一个约25k Da大小的分泌性蛋白,经纯化后纯度达90%以上;Western blot鉴定Tipα可与His标签抗体产生特异性反应。2.一定浓度的Tipα蛋白可显著诱导巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-18;Tipα蛋白浓度为40μg/ml时,刺激细胞6h后,TNF-α、IL-18和IL-1β表达水平接近峰值(P0.05)。3.特异性阻断NF-κB信号通路后,ELISA结果显示巨噬细胞分泌的促炎细胞因子较阻断前明显降低,Western blot结果显示Caspase-1和NLRP3分子的表达水平较阻断前均有明显降低。4.ROS清除剂NAC预处理细胞后,ELISA结果显示巨噬细胞分泌的IL-18和IL-1β较处理前有明显降低,TNF-α没有明显变化(P0.05);Western blot结果显示Caspase-1和NLRP3分子的表达水平较阻断前均有明显降低。结论:1.Tipα能促进巨噬细胞产生促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-18。2.NLRP3/Caspase-1途径可能参与了Tipα诱导的IL-1β和IL-18分泌。
【关键词】：幽门螺杆菌 Tipα 细胞因子 NLRP3炎性小体
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 常用英文缩写10-16
• 第1章 前言16-20
• 第2章 实验材料20-24
• 1 主要实验仪器20-21
• 2 载体、菌株及细胞株21
• 3 主要实验试剂21-24
• 3.1 主要试剂盒21
• 3.2 主要实验试剂21-22
• 3.3 培养基及溶液22
• 3.4 其他22-24
• 第3章 实验方法24-38
• 1 目的基因Tipα的扩增24-26
• 1.1 H. pylori26695标准株的培养与其全基因组DNA模板的提取24
• 1.2 目的基因Tipα的引物的设计与合成24-25
• 1.3 PCR扩增目的基因Tipα25
• 1.4 纯化目的基因PCR产物25-26
• 2 构建Tipα原核表达载体26-29
• 2.1 p ET-30 a (+)质粒的扩增与纯化26
• 2.2 目的基因Tipα和p ET-30 a (+)质粒的双酶切26-27
• 2.3 目的基因Tipα和p ET-30a(+)质粒的连接27
• 2.4 制备感受态细菌27-28
• 2.5 连接产物的转化28
• 2.6 重组质粒的筛选与鉴定28-29
• 3 Tipα重组蛋白的表达、鉴定和纯化29-34
• 3.1 Tipα重组蛋白的诱导表达29-31
• 3.2 Tipα重组蛋白的Western Blot鉴定31-32
• 3.3 Tipα重组蛋白的大规模诱导表达和纯化32-33
• 3.4 Tipα重组蛋白去内毒素33
• 3.5 蛋白浓度的测定33-34
• 4 THP-1 细胞培养和模型建立34
• 4.1 THP-1 细胞培养34
• 4.2 THP-1 细胞诱导成巨噬细胞的模型建立34
• 5 ELISA检测促炎细胞因子TNF-α、IL-18 和IL-1β水平34-35
• 5.1 TNF-α的检测34-35
• 5.2 IL-18 的检测35
• 5.3 IL-1β的检测35
• 6 ELISA检测阻断信号通路后对各促炎细胞因子表达的影响35
• 7 Western Blot检测阻断信号通路前后NLRP3、Caspase-1 的表达变化35-38
• 7.1 已刺激巨噬细胞的收集和处理35-36
• 7.2 Western Blot检测36-38
• 第4章 实验结果38-52
• 1 Tipα重组蛋白的诱导表达与鉴定38-47
• 1.1 Tipα基因的PCR扩增结果38
• 1.2 重组质粒p ET30a(+)/Tipα的菌液PCR鉴定38-39
• 1.3 重组质粒p ET30a(+)/Tipα的双酶切鉴定39-40
• 1.4 基因比对分析40-41
• 1.5 Tipα/p ET30a(+)重组质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达和鉴定41-45
• 1.6 Tipα重组蛋白的纯化45-46
• 1.7 Tipα重组蛋白的浓度测定46
• 1.8 Tipα重组蛋白的鉴定46-47
• 2 Tipα刺激对THP-1 细胞分泌细胞因子的影响47-48
• 3 PDTC对Tipα诱导巨噬细胞分泌促炎细胞因子以及表达Caspase-1 和NLRP3的影响48-50
• 4 NAC对促炎细胞因子的分泌及Caspase-1 和NLRP3的表达的影响50-52
• 第5章 讨论52-56
• 第6章 结论56-58
• 参考文献58-62
• 文献综述62-70
• 参考文献67-70
• 附录70-74
• 发表的论文与参与课题74-76
• 致谢76

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本文编号：685766