金黄色葡萄球菌氨基糖苷类、喹诺酮耐药基因的研究
发布时间：2017-08-17 10:21
本文关键词：金黄色葡萄球菌氨基糖苷类、喹诺酮耐药基因的研究
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【摘要】：目的:金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(SA)]是人类化脓感染中最常见的病原菌,可引起局部化脓感染,也可引起肺炎及败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌是院内感染的常见细菌之一,许多国家都设有专门机构,应对金葡菌的院内感染问题。随着内酰胺类抗生素的广泛应用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)随之增加,且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势。MRSA可通过接触途径进行传播,即易感人群从携带者或感染者身上获得MRSA,导致传播流行。腺苷酰转移酶是一种跨膜多重药物外排蛋白,介导了葡萄球菌对氨基糖苷类药物(主要是亲水性氨基糖苷类药物)及多种结构上近似甚至无关的药物耐药。该菌对多种广谱抗菌药物耐药,给临床治疗带来很大困难。因此,对其耐药机制、耐药基因的传播与转移的研究具重要的临床意义。本研究首次对临床分离SA氨基糖苷类耐药基因adenylyltransferase gene、氟喹诺酮耐药基因Nor A进行克隆、测序、表达及初步功能研究,为进行Adenylyltransfe rase、Nor A蛋白高级结构测定的结晶试验提供必须材料,同时对耐药基因的深入功能研究奠定基础,为从分子水平开展医院SA耐药株感染的控制和监测提供依据。方法:取SA临床分离株复苏、鉴定。采用离心柱型DNA抽提纯化试剂盒提取SA染色体DNA,根据Genbank公布的SA基因序列设计特异性引物,以染色体DNA为模板,通过PCR技术扩增adenylyltransferase、Nor A全基因,PCR产物纯化后与p GEX-4t-1载体连接,连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α,挑取经氨苄筛选的阳性菌落提取质粒并经双酶切及测序鉴定。转化大肠杆菌E.coli BL21,经双酶切鉴定后以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹法(Western blot)分析表达结果;并对p GEX-4T-1-adenylyltransferase/BL21重组株进行氨基糖苷类类药敏实验。另收集临床分离的22株金黄色葡萄球菌,采用PCR法检测adenylyltransferase、Nor A基因的携带率。结果:复苏的细菌经再鉴定确定为SA,以SA染色体DNA为模板,PCR扩增出两个大小分别约783bp、1167bp左右的片段并将其成功克隆入T载体。序列比对分析显示adenylyltransferase开放阅读框长783bp,编码29.9k Da蛋白;NORA开放阅读框长1167bp,编码43.9k Da蛋白。成功构建高效表达载体p GEX-4T-1-adenylyltransferase/NORA,经IPTG诱导分别获得分子量约55k Da、69k Da的融合表达蛋白,与预期分子量相符。重组体大肠杆菌药敏结果显示,p GEX-4T-1-NORA/BL21的MIC与p GEX-4T-1/BL21相比仅CIP有2级浓度差异,其余结果一样。22株金黄色葡萄球菌中检出腺苷酰转移酶耐药基因9株,检出率为40%;NORA基因12株,检出率为45%。结论:成功构建了金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因adenylyltransferase、耐氟喹诺酮耐药基因Nor A的T载体及高效原核表达载体p GEX-4T-1-adenylyltransferase/Nor A/并获得2个重组蛋白的大量表达;重组体大肠杆菌药敏结果显示,p GEX-4T-1-NORA/BL21的MIC与p GEX-4T-1/BL21相比仅CIP有2级浓度差异,其余结果一样。22株临床分离金黄色葡萄球菌携带adenylyltransferase、NORA基因的比率分别为45%、40%。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 腺苷酰转移酶耐药基因 多重耐药转运蛋白基因 克隆 表达
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：
- 中文摘要5-7
- Abstract7-9
- 前言9-14
- 第一章 金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因与氨基糖苷类耐药的相关性研究14-33
- 1.1 实验材料14-16
- 1.2 实验方法16-25
- 1.3 结果25-31
- 1.3.1 SA的培养及鉴定25
- 1.3.2 染色体 DNA 的提取及 SA 腺苷酰转移酶耐药基因的 PCR 结果25-26
- 1.3.3 p GEX-4T-1-adenylyltransferase 重组质粒的双酶切结果26-27
- 1.3.4 p GEX-4T-1-adenylyltransferase 重组质粒的测序结果27-28
- 1.3.5 p GEX-4T-1-adenylyltransferase 重组质粒的鉴定28-29
- 1.3.6 SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达29
- 1.3.7 Western blot 检测 GST-adenylyltransferase 融合蛋白29-31
- 1.3.8 腺苷酰转移酶耐药基因检测结果31
- 1.4 讨论31-32
- 1.5 小结32-33
- 第二章 金黄色葡萄球菌氟喹诺酮NORA耐药基因的克隆与表达33-51
- 2.1 材料与方法34-37
- 2.2 实验方法37-42
- 2.3 结果42-49
- 2.3.1 SA NORA基因的PCR结果42
- 2.3.2 p GEX-4T-1-NORA 重组质粒的双酶切结果42-43
- 2.3.3 p GEX-4T-1-NORA 重组质粒的测序结果43-44
- 2.3.4 p GEX-4T-1-NORA 重组质粒的鉴定44-45
- 2.3.5 SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达45
- 2.3.6 Western blot 检测重组融合蛋白45-47
- 2.3.7 NORA 基因检测结果47
- 2.3.8 E-test 检测重组体的药敏结果47
- 2.3.9 SA130903014 对常用抗菌药的耐药性47-48
- 2.3.10 SA 对氟喹诺酮类药物的耐药性与 NORA 耐药基因的关系48-49
- 2.4 讨论49-50
- 2.5 小结50-51
- 第三章 广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的临床分布及耐药性分析51-57
- 3.1 材料与方法51-52
- 3.2 结果52-54
- 3.3 讨论54-56
- 3.4 小结56-57
- 结论57-58
- 参考文献58-62
- 综述62-69
- 参考文献67-69
- 附录： 缩略词69-70
- 致谢70-71
- 攻读学位期间发表的论文71
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 李玉红,邹全明;氨基糖苷类钝化酶耐药机制的研究进展[J];国外医学.药学分册;2005年03期
2 刘倩;许学年;周岩;程娜;董玉婷;郑华军;朱永强;冯正;;华支睾吸虫含串联重复序列的Cs22抗原蛋白的克隆及特征分析[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2013年04期
3 高s，
本文编号：688477
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