钩端螺旋体LA2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶活性的研究

发布时间：2017-08-18 11:43

  本文关键词：钩端螺旋体LA2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶活性的研究

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【摘要】：目的确定问号钩端螺旋体(简称钩体)LA2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶活性(PAF-AH)、感染细胞时表达与分泌情况,以及诱导金地鼠内脏出血的作用。方法采用PCR扩增问号钩体黄疸出血群赖型赖株无信号肽LA2144基因并构建其原核表达系统,采用Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白rLep-PAF-AH。采用分光光度法检测rLep-PAF-AH水解PAF底物的活性、水解效率及Km和Kcat值。采用实时荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)和Western Blot法分别检测问号钩体赖株感染人脐静脉内皮细胞HUVEC、人单核细胞THP-1和小鼠巨噬细胞J774A.1后,LA2144基因mRNA (Lep-PAF-AH-mRNA)水平变化及产物外分泌情况。金地鼠尾静脉两次注射100μg无LPS的rLep-PAF-AH后观察肺、肝、肾组织中出血情况。结果所构建的问号钩体赖株LA2144基因原核表达系统在IPTG诱导下能高效表达rLep-PAF-AH, Ni-NTA亲和层析法提纯的rLep-PAF-AH经SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。5 μg rLep-PAF-AH对底物的水解效率为26.6 U/L,其Km和Kcat值分别为82.79 μmol/L和0.24 S-1。问号钩体赖株与HUVEC、THP-1和J774A.1细胞共培养1或2 h,Lep-PAF-AH-mRNA水平显著升高(p0.05)。问号钩体赖株与上述细胞共培养2～12 h,培养物上清中检出大量Lep-PAF-AH,但其EMJH培养物上清中未检出Lep-PAF-AH。 rLep-PAF-AH注射金地鼠出现肺出血,但肝、肾组织中无明显出血现象。结论LA2144基因产物具有较强PAF-AH活性,感染细胞时表达上调并外分泌、诱导金地鼠肺出血,故是问号钩体感染时引起宿主出血的重要毒力因子。
【关键词】：问号钩端螺旋体/LA2144基因 血小板活化因子乙酰水解酶 基因表达/蛋白分泌 出血
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R377.5
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-11
• 1 引言11-13
• 2 问号钩体LA2144基因原核表达系统构建及抗血清制13-36
• 2.1 材料13-18
• 2.2 方法18-33
• 2.3 结果33-36
• 3 rLep-PAF-AH的PAF-AH酶活性测定36-41
• 3.1 材料36
• 3.2 方法36-39
• 3.3 结果39-41
• 4 问号钩体感染细胞前后Lep-PAF-AH-mRNA水平变化41-48
• 4.1 材料41-42
• 4.2 方法42-47
• 4.3 结果47-48
• 5 问号钩体感染细胞前后Lep-PAF-AH表达和分泌检测48-52
• 5.1 材料48-49
• 5.2 方法49-50
• 5.3 结果50-52
• 6 Lep-PAF-AH在宿主内脏组织出血中的作用研究52-56
• 6.1 材料52
• 6.2 方法52-54
• 6.3 结果54-56
• 7 讨论56-59
• 8 结论59-60
• 参考文献60-63
• 综述63-74
• 参考文献69-74
• 作者简介及在读期间所取得的科研成果74

【参考文献】

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1 郑林立;葛玉梅;胡玮琳;严杰;;感染过程中钩端螺旋体外膜蛋白抗原表达水平变化及其调控机制[J];浙江大学学报(医学版);2013年02期

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本文编号：694414