基于流式细胞术的scFv抗体库筛选技术的建立

发布时间：2017-08-18 12:32

  本文关键词：基于流式细胞术的scFv抗体库筛选技术的建立

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【摘要】：目的利用NlpA前导肽诱导抗体锚定细菌内膜建立筛选scFv抗体库的展示技术,为高亲和力抗体的筛选奠定基础。方法从pNAD质粒中克隆出NlpA前导肽基因序列,酶切后将该序列克隆进pHEN1表达载体中。以PEAI质粒为模板,利用PCR的方法克隆得到抗-hIL-1β抗体的重链可变区和轻链可变区基因,然后利用重叠PCR的方法构建得到抗-hIL-1βscFv抗体。将scFv抗体插入到NlpA leader-pHEN1表达载体中构建成展示scFv的重组质粒pBSD-scFv。将pBSD-scFv转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果所展示的抗-hIL-1βscFv抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBSD-scFv-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论经过该细菌展示系统展示的scFv抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异结合能力。
【作者单位】： 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所;东北农业大学生命科学学院生物制药教研室;
【关键词】： 细菌展示 流式细胞仪筛选 scFv抗体库
【基金】：哈尔滨市科技创新人才研究专项资金(2008RFQXS017) 国家自然科学基金(201031001084;30700591)
【分类号】：R392.11
【正文快照】： 基因工程抗体由于其高专一性、高亲和力、高效性和高可塑性被广泛应用于疾病的临床诊断、预防、治疗及基础理论研究等领域[1]。目前筛选抗体的方法有噬菌体展示技术、酵母展示技术、核糖体展示技术、细菌展示技术等。与细菌展示技术相比,噬菌体展示技术耗时费力,酵母展示技术

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 刘向昕,展德文,张兆山;细菌表面展示技术的应用研究进展[J];微生物学免疫学进展;2005年02期

2 尹成凯;徐黎明;任桂萍;张巧;刘向宇;田辉;李德山;;酵母展示筛选scFv方法的建立[J];细胞与分子免疫学杂志;2009年12期

3 徐黎明;尹成凯;任桂萍;田辉;王雪琴;丁良君;李德山;;筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年10期

4 李月红;张国力;岳玉环;吴广谋;朱平;;细胞黏附分子1(ICAM-1)ScFv基因原核载体的构建及表达[J];中国兽医学报;2012年05期

5 田辉;白福良;徐黎明;王文飞;牛泽杉;任桂萍;李德山;;错配PCR技术提高抗hIL17A单链抗体亲和力的研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2012年07期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 辛忠涛;应用细菌表面展示技术快速筛选抗原表位及研制应急疫苗[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 封小燕;王艳春;李平超;陶好霞;王們;袁盛凌;王令春;王普;刘纯杰;;幽门螺杆菌Ure B串联融合表位的表面呈现表达[J];中国生物工程杂志;2011年08期

2 徐黎明;尹成凯;任桂萍;田辉;王雪琴;丁良君;李德山;;筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年10期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 封小燕;王艳春;李平超;陶好霞;王們;袁盛凌;王令春;王普;刘纯杰;;幽门螺杆菌Ure B串联融合表位的表面呈现表达[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 张卫卫;弧菌琼胶酶和丝氨酸蛋白酶的筛选、分析以及免疫应用[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2009年

2 岳礼溪;解脂耶罗威亚酵母菌表面展示质粒的构建及应用的初步研究[D];中国海洋大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 郑迎迎;人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及表达[D];南京理工大学;2006年

2 孙超;抗Aβ人源性抗体的制备[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

3 邓思;GST-SrtA融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定[D];华南理工大学;2012年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杜勇,周建军,王海涛;应用细菌鞭毛递呈的随机肽库研究丙型肝炎病毒核心蛋白B细胞抗原表位[J];病毒学报;1998年04期

2 贾帅争;真核蛋白表面展示系统[J];国外医学(分子生物学分册);2000年01期

3 甘人宝,储美瑾,沈绿萍,钱苏雯,李载平;克隆的adr亚型乙型肝炎病毒(pADR-1)DNA的全顺序[J];中国科学(B辑 化学 生物学 农学 医学 地学);1986年01期

4 琦祖和,阎s，

本文编号：694586