大肠杆菌表面展示结核分枝杆菌PepA、PPE18和EsxH蛋白及其免疫原性研究

发布时间：2017-08-20 13:00

  本文关键词：大肠杆菌表面展示结核分枝杆菌PepA、PPE18和EsxH蛋白及其免疫原性研究

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【摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的人、畜、禽共患的慢性消耗性传染病,与艾滋病及疟疾共同成为人类健康的三大威胁。2013年,有900万人罹患结核病,150万人死于该病。随着耐药结核分枝杆菌的散播及艾滋病蔓延,对结核病的控制与防治面临着巨大挑战。但是,目前已报道的针对结核病的几种疫苗都有一定的局限性。接种卡介苗(BCG)是预防结核病的主要方式,但存在保护效率低、免疫保护效果有限等问题;DNA疫苗的有效性仍有待提高;亚单位疫苗的免疫应答持续时间短、应用受限,因此发展高效、安全并可广泛应用的新型结核疫苗已迫在眉睫。本研究通过构建细菌表面展示载体,在大肠杆菌表面展示结核分枝杆菌PepA、PPE18和EsxH蛋白,对其免疫效果进行研究,评价其作为活载体疫苗应用于结核病防控的潜力。本研究将PepA、PPE18和EsxH的编码基因rv0125、rv1196、rv0288及三个基因的融合基因rv0288-1196-0125分别克隆于构建的INP表面展示载体,转化至大肠杆菌,通过不同方法验证外源蛋白的表达定位和表达量。免疫印迹结果显示,三个编码基因及融合基因均有表达,可检测到预期大小的蛋白条带;对亚细胞组分的检测结果显示,目的蛋白均定位于细胞膜与细胞壁;进一步应用蛋白酶K作用后,特异性的目的蛋白被消化,被降解为许多小分子量氨基酸肽段;激光共聚焦显微镜下可观察到免疫染色后细菌表面的特异性荧光信号。以小鼠为动物模型,用所构建的表面展示活疫苗载体经腹腔注射免疫小鼠,定期采取血清、分离脾脏淋巴细胞,分别检测抗体水平、细胞因子水平、CD4+和CD8+水平,分析免疫效果。研究结果表明,与对照组相比,各免疫组抗体水平均有较大程度的提升,在三免二周后,INP-0288组的抗体水平为空载体对照组的4倍,既使抗体水平最低的INP-0288-1196-0125组也为空载体对照组2倍,显示上述表面展示活疫苗载体能刺激机体产生针对所展示蛋白的高水平特异性抗体。各免疫组CD4+T细胞呈现上升趋势,而对于CD8+T细胞,INP-0288免疫组呈现上升趋势,其余三组呈现上升后轻微下降的趋势,但水平均高于对照组;INP-0288组的CD4+/CD8+表现为上升后轻微下降的趋势,其余三组呈现出下降后上升的趋势。细胞因子水平存在明显差异:对于IFNγ,相比于空白组各免疫组水平均表现为下降,水平低于空白组;对于IL-4,各时间点各免疫组水平明显提高;IL-17A的检测中,相比于空白组,INP-0288组明显升高,而其余三组表现为水平降低。综上所述,本研究利用所构建的表面展示载体INP,将结核分枝杆菌PepA、PPE18、EsxH及其融合蛋白展示于大肠杆菌表面,所构建的4种蛋白表面展示活疫苗载体均能够在小鼠中激发强烈的体液与细胞免疫。本研究为新型结核疫苗的研制奠定了良好的基础,为结核病的防控提供了新的思路。
【关键词】：分枝杆菌 表面展示 PepA PPE18 EsxH
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 结核病简介12-16
• 1.1.1 结核病病原学12-13
• 1.1.2 结核病流行病学13-14
• 1.1.3 结核病的防控14-16
• 1.2 细菌表面展示系统的发展与应用16-18
• 1.3 冰核蛋白展示系统18
• 1.4 PepA, PPE18, EsxH18-21
• 1.5 研究目的和意义21-22
• 第二章 结核分枝杆菌PepA、PPE18和Esx H蛋白表面展示疫苗载体的构建22-37
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 载体和菌株22
• 2.1.2 主要试剂22
• 2.1.3 主要仪器22
• 2.1.4 主要溶液及培养基22-24
• 2.2 实验方法24-29
• 2.2.1 引物设计与基因PCR扩增24-25
• 2.2.2 重组质粒的构建25-26
• 2.2.3 重组菌的构建26
• 2.2.4 激光共聚焦检测26-27
• 2.2.5 目的蛋白的SDS-PAGE、免疫印迹检测27
• 2.2.6 目的蛋白超速离心法分离组分27
• 2.2.7 目的蛋白蛋白酶K处理27-28
• 2.2.8 目的蛋白激光共聚焦观察28-29
• 2.3 实验结果29-36
• 2.3.1 基因PCR扩增结果29-30
• 2.3.2 重组质粒鉴定结果30
• 2.3.3 EGFP激光共聚焦检测结果30-31
• 2.3.4 目的蛋白免疫印迹检测结果31-32
• 2.3.5 目的蛋白超速离心法分离组分结果32-34
• 2.3.6 目的蛋白的蛋白酶K消化结果34-35
• 2.3.7 目的蛋白激光共聚焦观察结果35-36
• 2.4 讨论36-37
• 第三章 结核分枝杆菌PepA, PPE18和Esx H蛋白表面展示疫苗免疫效果评价37-48
• 3.1 实验材料37-38
• 3.1.1 实验动物37
• 3.1.2 试剂37
• 3.1.3 主要仪器37
• 3.1.4 主要溶液37-38
• 3.2 实验方法38-40
• 3.2.1 小鼠免疫38
• 3.2.2 多肽包被ELISA法检测抗体效价38-39
• 3.2.3 细胞壁组分包被ELISA法检测抗体效价39
• 3.2.4 小鼠脾脏淋巴细胞的分离39
• 3.2.5 流式细胞术检测CD4+T和CD8+T细胞39
• 3.2.6 小鼠外周血细胞因子的检测39-40
• 3.3 实验结果40-45
• 3.3.1 多肽包被ELISA法检测抗体水平40-41
• 3.3.2 细胞壁组分包被ELISA法检测抗体水平41-42
• 3.3.3 流式细胞术检测CD4+T和CD8+T细胞结果42-43
• 3.3.4 小鼠外周血细胞因子的检测结果43-45
• 3.4 讨论45-48
• 第四章 结论48-49
• 参考文献49-56
• 致谢56-57
• 作者简介57

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本文编号：706721