基于miR30骨架的HPSE-shRNA慢病毒载体的构建及其效应研究

发布时间：2017-08-23 20:21

  本文关键词：基于miR30骨架的HPSE-shRNA慢病毒载体的构建及其效应研究

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【摘要】：目的:模拟miR30的框架结构设计针对HPSE的shRNA,将其克隆至慢病毒载体的CMV启动子调控的表达框内,实现Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控。方法:设计3条基于miR30骨架的HPSE-shRNA,通过PCR获得目的片段,回收后与线性化LV PP-GFP载体连接产生重组慢病毒载体LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒,感染A375细胞。以实时荧光定量PCR检测HPSE-mRNA的表达情况,以Westen blot检测HPSE蛋白的表达水平。结果:构建出以miR30为骨架的针对HPSE的慢病毒干扰载体,经阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确。实时荧光定量PCR和Westen blot结果表明,LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA重组病毒感染后A375细胞HPSE-mRNA和蛋白的表达明显降低。结论:本研究成功构建了以miR30为骨架的HPSE-shRNA慢病毒载体,实现了Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控,为今后实现溶瘤病毒介导RNAi提供了实验依据。
【作者单位】： 浙江大学医学院附属第一医院皮肤科;
【关键词】： 慢病毒属 遗传载体 RNA干扰 微RNAs RNA聚合酶Ⅱ 转录启动子 葡糖醛酸糖苷酶 聚合酶链反应
【基金】：国家自然科学基金资助项目(30771944)
【分类号】：R346
【正文快照】： RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因沉默现象,其作用机制是通过活化的小干扰RNA(smallinterference RNA,siRNA)靶向降解目的mRNA,从而使目的基因表达沉默,是目前简单而高效的阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法之一。microRNA(miRNA)是一类

【参考文献】

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【二级参考文献】

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本文编号：727123