人鼻病毒非结构蛋白2B激活PERK-eIF2α信号通路引起内质网应激的机制研究

发布时间：2017-09-03 00:08

  本文关键词：人鼻病毒非结构蛋白2B激活PERK-eIF2α信号通路引起内质网应激的机制研究

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【摘要】：人类鼻病毒(Human rhinovirus, HRV)是普通感冒最重要的病原体。HRV除了可以引起上呼吸道感染,还可以造成严重的下呼吸道疾病,如细支气管炎、肺炎、喘息性疾病等。此外,HRV还可与其他病毒和细菌发生共同感染而加重哮喘和慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)病情进展。根据基因序列同源性分析,HRV可分为HRV-A、HRV-B口HRV-C 3组。超过90%的HRV-A和-B利用细胞间粘附分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)作为进入细胞的受体,极少数约10个血清型通过低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)受体进入细胞[3,41。HRV进入人体后,主要在呼吸道上皮细胞及局部淋巴组织中增殖,造成被感染组织细胞病变以及炎性反应。然而,HRV引发呼吸道疾病的具体致病机制还不十分清楚。HRV感染敏感细胞后,通过破坏上皮细胞屏障,尤其破坏了紧密连接,而引起血管渗漏和粘膜分泌增加。HRV感染鼻粘膜上皮细胞后,可降低zona occluden (ZO)-1、claudin-1和E-钙粘素的mRNA和蛋白表达水平,损伤粘膜屏障。细胞渗透性的增加,上皮细胞屏障的破坏均有利于病毒及其诱导物的转位,病毒等转位后与暴露出的上皮基底细胞受体(如TLR和PRRs)结合诱导先天性免疫反应。HRV通过对细胞结构和功能的显著影响,如细胞膜结构的变化,干扰胞内的Ca2+平衡,引起细胞凋亡和细胞自噬[7-9],来调控自身的复制。内质网(Endoplasmic Reticulum, ER)广泛存在于除哺乳动物成熟的红细胞外的各种真核细胞中。承担着细胞内蛋白质合成、折叠、修饰和运输的作用,此外,还是细胞内Ca2+的重要储存器,调节细胞应激反应、Ca2+水平以及蛋白质合成、折叠和运输的调节过程。细胞ER膜上存在三种调控内质网稳态的跨膜蛋白[11]：需肌醇蛋白1(Inositol Requiring enzyme 1, Irel)、双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like ER kinase, PERK)和活化转录因子6(activating transcription factor-6, ATF6)。正常情况下, GRP78(78KD Glucose Regulated Protein)结合三种跨膜蛋白的ER腔内段而抑制其活性。病毒感染等可引起ER上Ca2+通道的改变,从而造成ER腔内钙稳态的改变；并影响蛋白质合成、修饰和折叠,产生未折叠和错误折叠蛋白,过多的未折叠和错误折叠蛋白诱发内质网应激(ERstress, ERS)。在ERS反应过程中,细胞通过未折叠蛋白反应(Unfolding protein response, UPR)和内质网超载反应(ER overlod response, EOR)来降低蛋白质的合成,促进蛋白质的正确折叠,三种跨膜蛋白质与GRP78发生解离,IRE1和PERK发生寡聚化及其自身磷酸化,刺激下游信号的激活。ATF6从ER转位至高尔基体,先后被S1P与S2P蛋白酶切割,释放出N端转录激活结构域,产生活化型ATF6。同时,UPR引起GRP78等反应性高表达,激活ER相关的蛋白降解(ER assciated degradation, EARD)通路降解不正常蛋白,以恢复内质网稳态。当损伤太过严重,超出了UPR的调控范围,内环境稳态持续紊乱无法及时恢复,ERS则将促生存信号转化促凋亡信号,诱导细胞凋亡的级联反应。多项研究表明ER与支气管哮喘和COPD的病理发生密切相关[13,14],且通过ERS通路中的PERK调控NFK B而影响炎性反应。研究显示,多种小RNA病毒的非结构2B蛋白可以在ER上形成膜通道,造成细胞损伤[15-18],包括增加细胞膜结构的通透性和干扰胞内Ca2+平衡。而由95个氨基酸组成的HRV的2B蛋白也具有两个疏水区,有研究发现HRV16 2B蛋白可定位表达于细胞的内质网上,并对蛋白分泌运输造成一定影响[19]。由此我们推测HRV的2B蛋白可能诱导ERS,并在HRV的致病中发挥一定的作用。因此我们针对HRV的2B蛋白对细胞ERS的诱导展开研究。为深入了解HRV的非结构蛋白2B对细胞的影响,我们构建了HRV16的2B真核表达载体p2B-GFP,转染BHK-21细胞,检测ERS的相关蛋白和通路的激活情况。结果发现,HRV16非结构蛋白2B定位表达于内质网,且显著增加了GRP78的表达,同时,还激活了ATF4和ATF6,这些证据提示了HRV16非结构蛋白2B诱导了ERS。针对ERS通路激活情况的探讨发现,HRV16 2B蛋白显著诱导了PERK的磷酸化、eIF2α的磷酸化和CHOP的表达增加。另外,]HRV16 2B蛋白使得RE1、p-IRE1的表达下降。关于ATF6的免疫印迹检测未发现其明确的活化增加。这些结果表明HRV16 2B蛋白通过激活PERK-eIF2α信号通路介导了BHK-21细胞的ERS,而不是通过IRE1和ATF6通路。在研究中,我们还发现HRV16非结构蛋白2B表达于细胞后,细胞出现了核浓缩的凋亡现象,且PARP蛋白发生降解,这提示HRV162B蛋白诱导细胞出现了细胞凋亡。本研究发现的HRV16非结构蛋白2B对细胞ERS及凋亡的诱导,为阐明鼻病毒非结构蛋白2B的细胞损伤机制奠定了一定的基础,也为抗病毒药物设计提供了新的潜在靶点。
【关键词】：鼻病毒 非结构蛋白2B 内质网应激 PERK-eIF2α
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.1
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 引言10-16
• 实验材料与方法16-31
• 一、实验材料16-21
• 二、实验方法21-31
• 实验结果31-41
• 一、重组质粒p2B-GFP的构建与鉴定31-33
• 二、HRV16 2B蛋白通过PERK-eIF2α信号通路诱导ERS33-38
• 三、HRV16 2B蛋白诱导BHK-21细胞凋亡38-41
• 讨论41-47
• 小结47-48
• 参考文献48-53
• 综述53-63
• 参考文献61-63
• 缩略词对照表63-66
• 作者简介66-68
• 致谢68-69
• 附录69

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