金黄色葡萄球菌受体蛋白ArlS胞浆域的表达、纯化及活性研究

发布时间：2017-09-04 20:43

  本文关键词：金黄色葡萄球菌受体蛋白ArlS胞浆域的表达、纯化及活性研究

  更多相关文章： 金黄色葡萄球菌 ArlS 蛋白纯化 激酶活性

【摘要】：金黄色葡萄球菌是一种典型的革兰氏阳性菌,它是人类主要的病原菌之一,可引起伤口的化脓感染,诱发内脏器官感染,导致肺炎,心内膜炎及脓毒血症等一系列疾病,可以导致人免疫能力的降低甚至死亡。金黄色葡萄球菌的致病机制与其能分泌多种细胞外毒素及胞外酶密切相关,当细菌对寄主细胞造成感染后将会表达一系列的毒力因子,这些毒力因子的表达受多个基因组成的复杂网络调控。arl双组份信号转导系统直接或间接调控多种毒力因子的表达,该系统中的组氨酸激酶蛋白ArlS可以感受胞外信号并将信号传递至胞内,引起反应调控蛋白ArlR的磷酸化并开启arl系统。因此,以ArlS蛋白以及arl双组份信号转导系统作为治疗金黄色葡萄球菌感染的药物靶点,对于减轻或抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的产生,达到控制金黄色葡萄球菌感染的目的具有重要意义。本文首先利用无限制克隆法扩增目的基因,利用酶切酶连的方法构建了pProEX-HTa-arls和pProEX-HTa-arlr重组质粒,化学法转入DH5α感受态细胞中。将测序成功的重组质粒化转入大肠杆菌BL21(RIL)中,对目的蛋白进行诱导表达。其次,利用金属离子螯合层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析方法对目的蛋白进行分离纯化,纯化后的ArlR蛋白纯度可达98%,产量约为25 mg/L;纯化后的ArlS蛋白纯度可达90%,产量约为15 mg/L。利用圆二色谱检测纯化后的ArlR蛋白,结果显示纯化后的目的蛋白具有完整的二级结构。利用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay方法测定ArlS蛋白的激酶活性,检测结果显示纯化后的ArlS蛋白具有激酶活性。体外磷酸化结果显示,ArlS蛋白自磷酸化后可以将磷酸基团转移,进而磷酸化下游的反应调控蛋白ArlR。最后,利用定点突变的方法,构建了418位和420位氨基酸残基突变的表达载体即pProEX-HTa-ArlS_(CAG418A)和pProEX-HTa-ArlS_(CAG420A)。经诱导表达及分离纯化后得到对应的目的蛋白即ArlS_(CAG418A)和ArlS_(CAG420A),利用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay方法测定蛋白激酶活性,结果显示ArlS_(CAG418A)和ArlS_(CAG420A)蛋白不具有激酶活性,证明了418位和420位氨基酸残基在ArlS蛋白的自磷酸过程中起着关键作用。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 ArlS 蛋白纯化 激酶活性
【学位授予单位】：大连工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.11
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文献综述10-25
• 1.1 金黄色葡萄球菌的致病性及耐药性10-11
• 1.1.1 金黄色葡萄球菌10
• 1.1.2 金黄色葡萄球菌的致病性10-11
• 1.1.3 金黄色葡萄球菌的耐药性11
• 1.2 细菌群体感应系统11-14
• 1.2.1 细菌群体感应系统简介11-12
• 1.2.2 金黄色葡萄球菌双组份信号转导系统12-14
• 1.3 ArlRS双组份信号转导系统14-18
• 1.4 实验技术简介18-23
• 1.4.1 表达载体的构建18-19
• 1.4.2 蛋白纯化及检测技术介绍19-22
• 1.4.2.1 蛋白纯化技术19-21
• 1.4.2.1.1 金属离子螯合层析19-20
• 1.4.2.1.2 离子交换层析20-21
• 1.4.2.1.3 凝胶过滤层析21
• 1.4.2.2 蛋白检测技术21-22
• 1.4.2.2.1 电泳技术21-22
• 1.4.2.2.2 圆二色谱22
• 1.4.3 定点突变22-23
• 1.5 本研究工作的内容及意义23-25
• 第二章 ArlR及ArlS表达载体的构建及蛋白的诱导表达25-31
• 2.1 引言25
• 2.2 材料与方法25-29
• 2.2.1 实验材料25-27
• 2.2.1.1 菌株与质粒25
• 2.2.1.2 培养基及缓冲液25-26
• 2.2.1.3 试剂及仪器26-27
• 2.2.2 实验方法27-29
• 2.2.2.1 ArlS_(CA)和ArlR表达载体的构建及蛋白的诱导表达27-28
• 2.2.2.2 ArlS_(CA)和ArlR蛋白的表达28-29
• 2.3 结果与讨论29-31
• 2.3.1 ArlS_(CA)和ArlR表达载体的构建29-30
• 2.3.2 ArlS_(CA)和ArlR蛋白的诱导表达30-31
• 第三章 蛋白的分离纯化及活性检测31-43
• 3.1 引言31
• 3.2 材料与方法31-37
• 3.2.1 实验材料31-34
• 3.2.1.1 培养基及缓冲液31-33
• 3.2.1.2 试剂及仪器33-34
• 3.2.2 实验方法34-37
• 3.2.2.1 金属离子螯合层析技术纯化蛋白34-35
• 3.2.2.2 离子交换层析技术纯化ArlR蛋白35
• 3.2.2.3 凝胶过滤层析技术纯化蛋白35
• 3.2.2.4 圆二色谱检测ArlR蛋白二级结构35-36
• 3.2.2.5 ArlS_(CA)蛋白激酶活性的检测36-37
• 3.2.2.6 ArlS蛋白体外磷酸化ArlR蛋白37
• 3.3 结果与讨论37-43
• 3.3.1 ArlR蛋白的纯化37-38
• 3.3.2 ArlR蛋白二级结构的测定38-39
• 3.3.3 ArlS_(CA)蛋白的纯化及激酶活性的测定39-41
• 3.3.4 ArlS_(CA)蛋白激酶活性的研究41
• 3.3.5 ArlS_(CA)蛋白的体外磷酸化作用41-43
• 第四章 ArlS蛋白定点突变菌株的构建43-51
• 4.1 引言43-44
• 4.2 材料与方法44-47
• 4.2.1 实验材料44-45
• 4.2.2 实验方法45-47
• 4.2.2.1 构建定点突变表达载体45-47
• 4.2.2.2 表达纯化ArlS_(CA-G418A)和ArlS_(CA-G420A)蛋白47
• 4.2.2.3 ArlS_(CA-G418A)和ArlS_(CA-G420A)蛋白激酶活性的测定47
• 4.3 结果与讨论47-51
• 4.3.1 ArlS_(CA)蛋白定点突变表达载体的构建47-48
• 4.3.2 ArlS_(CA-G418A)和ArlS_(CA-G420A)蛋白的纯化48-49
• 4.3.3 ArlS_(CA-G418A)和ArlS_(CA-G420A)蛋白激酶活性的测定49-51
• 第五章 总结与展望51-53
• 5.1 总结51
• 5.2 展望51-53
• 参考文献53-57
• 攻读硕士学位期间发表论文情况57-58
• 附录58-63
• 附录A ArlS碱基序列58-59
• 附录B ArlR碱基序列59
• 附录C DNA凝胶回收操作步骤59-60
• 附录D PCR纯化操作步骤60
• 附录E 提取质粒操作步骤60-61
• 附录F SDS-PAGE操作方法61-62
• 附录G pProEX-HTa载体质粒图谱和多克隆位点信息62-63
• 致谢63-64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 邢启凡;柳鹏福;史吉平;孙玉梅;;细菌群体感应信号分子淬灭酶的研究进展[J];生物技术通报;2015年10期

2 刘琳娟;李琪;陈咪未;张青云;徐国兵;;肿瘤专科医院金黄色葡萄球菌的分布与耐药性分析[J];中华医院感染学杂志;2015年02期

3 袁本清;宋发谷;张爱群;龚萍;王廷波;吴慧玲;李强;张登玉;;金黄色葡萄球菌耐药性变迁探讨[J];中华医院感染学杂志;2014年24期

4 徐芳;李军;段云飞;刘晓光;;细菌群体感应信号网络及其应用[J];生物学杂志;2014年04期

5 张新;张红城;董捷;张根生;;蜂王浆主蛋白1低聚体的分离纯化及其圆二色谱分析[J];食品科学;2014年17期

6 陈叶红;丁洁卫;金燕;张林;张生大;;金黄色葡萄球菌耐药性变迁及抗菌药物应用分析[J];中华医院感染学杂志;2014年02期

7 胡文斌;;基因定点突变技术简介[J];生物学教学;2013年12期

8 刘彩林;孙自镛;陈中举;朱旭慧;李丽;张蓓;田磊;王斌;朱琴;汪s，

本文编号：793738