p53基因敲除对猪成纤维细胞自噬影响的实验研究

发布时间：2017-09-06 18:43

  本文关键词：p53基因敲除对猪成纤维细胞自噬影响的实验研究

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【摘要】：[目的]自噬是细胞在营养缺乏、毒性压力等条件下蛋白质动态降解过程,对维持细胞稳态,促进氨基酸等物质的循环再利用具有重要意义。p53基因参与细胞凋亡、增殖、衰老、代谢的调节,在噬调节中也扮演重要角色。p53基因能被不同压力激活或抑制,从而抑制或促进自噬发生后增加或减少细胞存活。课题组前期成功构建p53基因敲除的猪成纤维细胞模型,本研究通过Ebss溶液饥饿诱导p53基因不同表型成纤维细胞自噬,研究p53基因对自噬的影响,并通过RT-qPCR检测和初步筛选p53调控自噬的相关基因,为进一步研究p53调节自噬的具体分子机制奠定实验基础。[方法](1)倒置显微镜观察细胞形态；(2)应用MTT法检测细胞增殖活性；(3) Western blot检测蛋白水平变化；(4)细胞免疫荧光检测自噬蛋白变化；(5)电子透射显微镜观察细胞自噬体；(6) RT-qPCR方法检测细胞内mRNA水平的变化。[结果](1)p53基因敲除对猪成纤维细胞形态及增殖的影响显微镜下观察细胞形态发现,与p53-wt PEFs相比,p53-/- PEFs发生明显形态学改变,细胞胞体较小,界限不清,排列不规则；MTT法分析细胞1-7天生长情况结果示,两种细胞呈“S”型曲线生长,p53-/- PEFs的生长速度显著快于p53-wt PEFs (p0.05,n=3)。(2) Ebss饥饿处理对p53不同表型猪成纤维细胞形态及增殖的影响经EBSS处理Oh、24h、48h后显微镜下观察细胞形态变化,p53-wt PEFs较p53-/- PEFs对饥饿环境压力较敏感,细胞形态改变严重,并出现大量细胞死亡；MTT结果示, Ebss处理对p53-wt PEFs和p53-/-PEFs存活率影响的比较,24h为87.71%vs 95.11%(p0.05,n=3),48h为44.55% vs 63.85%(p0.01,n=3)。(3) Ebss饥饿处理对p53不同表型猪成纤维细胞自噬的影响Western blot检测自噬标记蛋白LC3B的表达,经Ebss 4h处理后,, p53-wt PEFs和p53-/- PEFs的LC3B-Ⅱ/β-actin表达升高,前者升高1.65倍,后者升高2.1倍,两者相比有显著性差异(p0.001,n=3)；另通过细胞免疫荧光检测同样处理下LC3B的表达情况,LC3B在p53-/- PEFs中的表达较p53-wt PEFs中明显升高；透射显微镜下观察细胞自噬形成情况,p53-wt PEFs中自噬体形成较少且处于自噬早期阶段,而p53-/- PEFs中大量自噬体形成且处于自噬晚期阶段。(4) Ebss饥饿处理对p53不同表型猪成纤维细胞自噬相关基因表达的影响成纤维细胞敲除p53基因后,以p53-wt PEFs为对照,mRNA表达差异1.5倍的基因有：Atg2a、Atg4a、Atg5、Atg13、DAPK、Vps15;当Ebss饥饿处理4h后,p53-wt PEFs中自噬相关基因mRNA水平大都呈表达改变不明显；而在p53-/- PEFs中自噬相关基因的mRNA水平呈上升趋势,其中上升倍数2.5倍的有Atg2a、Atg4a、Atg9a、Atg9b、Epg5、Vps15、DAPK、RAB1A;通过分析比较初步筛选出Atg9a、Atg9b、Epg5、RAB1A为p53调控自噬的潜在基因。[结论](1)p53基因在猪成纤维细胞的形态维持和细胞增殖中起重要作用。(2)p53基因敲除促进猪成纤维细胞的增殖速率及对饥饿压力的耐受力。(3)p53基因敲除后促进饥饿诱导的猪成纤维细胞自噬。(4)初步筛选出p53调控猪成纤维细胞自噬的相关基因Atg9b、Epg5、 RAB1A),为进一步研究具体分子机制奠定前期基础。
【关键词】：p53 自噬 饥饿 增殖 LC3
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R3416
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-16
• 技术路线16-17
• 材料与方法17-31
• 结果31-41
• 讨论41-45
• 结论45-46
• 参考文献46-51
• 综述51-59
• 参考文献56-59
• 攻读学位期间获得的学术成果59-60
• 致谢60

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本文编号：804808