Calpain活性与PSD-95在AD模型小鼠脑组织中的表达差异研究

发布时间：2017-09-08 17:28

  本文关键词：Calpain活性与PSD-95在AD模型小鼠脑组织中的表达差异研究

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【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种神经退行性疾病,主要表现为学习认知功能障碍和记忆减退,细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Ap)形成的老年斑和细胞内tau蛋白磷酸化形成的神经纤维缠结和脑部神经元的变性及突触丢失。钙蛋白酶(calpain)和PSD-95为突触相关蛋白,Ap的过量沉积引起神经细胞内Ca2+浓度的升高,进一步激活calpain,使tau蛋白过度磷酸化,进而引起神经纤维缠结,导致神经元和突触的缺失。而PSD-95的表达水平与AD患者体内Aβ水平负相关,AD患者脑组织内可观察到Aβ的增加及PSD-95的减少。本研究使用3×Tg-AD模型小鼠来检测calpain和PSD-95在AD疾病中的变化规律,分析突触相关蛋白发生显著变化的时间节点,研究突触损伤与AD发病机制的关系。结果如下：1、AD模型小鼠与同龄对照组相比：1月龄和3月龄脑内calpain活性与PSD-95蛋白水平无统计学差异(P0.05)；6月龄、9月龄、和12月龄脑内calpain活性显著上升(P0.05),而PSD-95蛋白水平显著降低(P0.05)；16月龄、20月龄AD小鼠脑内calpain活性极显著上升(P0.01),而PSD-95蛋白水平极显著降低(P0.01)。AD模型小鼠calpain活性与PSD-95蛋白表达在6月龄发生显著变化,说明6月龄是AD模型小鼠突触损伤出现的时间节点。2、随月龄的增加,对照组小鼠calpain活性升高但趋势缓慢,PSD-95蛋白水平降低但不明显(P0.05)。而AD模型小鼠6月龄calpain活性出现显著升高(P0.05),到16月龄出现极显著升高(P0.01),到20月龄calpain活性升高368.9%,差异极显著(P0.01)。而PSD-95蛋白水平6月龄显著下降(P0.05),到16月龄出现极显著降低(P0.01),到20月龄PSD-95水平降低了69.8%,差异极显著(P0.001)。结果进一步确认6、16月龄为AD模型小鼠calpain活性与PSD-95蛋白表达发生重大变化的节点。3、选择6月龄的AD模型小鼠进行重组嵌合抗原6Aβ15-TF和6Aβ15-THc-C的主动免疫治疗。与非免疫组AD模型小鼠相比,免疫治疗后的AD模型小鼠具有较好的体液免疫水平和细胞免疫水平,脑内毒性蛋白Aβ与tau得到有效清除,病理学特征得到极显著改善(P0.01),水迷宫行为学评价显示学习认知能力获得极显著改善(P0.01).结果表明我们使用的疫苗对AD模型小鼠具有明显的免疫治疗效果。4、免疫疗效显著的AD模型小鼠dynamin1, synaptophysin, synapsin1, GluR1等突触相关蛋白表达水平表现显著上调(P0.05),提示主动免疫治疗后的AD小鼠脑部神经元得到了较好的保护。虽然免疫治疗组AD模型小鼠的calpain和PSD-95在转录水平上未发现显著变化(P0.05),但是蛋白水平上calpain活性表现极显著下调(P0.01),PSD-95表现极显著上调(P0.01)。Calpain活性和PSD-95蛋白水平的变化与AD疫苗的主动免疫疗效及其他突触相关蛋白的变化相对应。综上所述,calpain活性与3×Tg-AD模型小鼠的病程发展呈正相关,PSD-95蛋白的表达水平与AD模型小鼠的病程发展呈负相关。免疫治疗后3×Tg-AD模型小鼠行为学能力获得改善,突触功能和认知能力有恢复。同其他突触相关蛋白相同,治疗后的AD模型小鼠脑内PSD-95表达显著上调,与疫苗的免疫疗效趋势一致,PSD-95可以作为潜在的药效学指标用于评价AD疫苗的免疫效果。
【关键词】：阿尔茨海默病 钙蛋白酶 突触后致密蛋白-95 表达差异 主动免疫治疗
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332;R749.16
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 1 引言13-21
• 1.1 突触损伤与AD的关系14-15
• 1.2 突触相关蛋白的功能15-18
• 1.2.1 钙蛋白酶(calpain)15
• 1.2.2 突触素(synapsins)15-16
• 1.2.3 囊泡整合蛋白(synaptophysin)16
• 1.2.4 动力蛋白(dynamin)16-17
• 1.2.5 突触后致密蛋白-95(postsynaptic density protein95,PSD-95)17
• 1.2.6 谷氨酸受体1(GluR1)17-18
• 1.3 突触相关蛋白在AD治疗药效学评价中的意义18-19
• 1.4 本研究的目的和意义19-21
• 2 实验材料21-23
• 2.1 实验动物21
• 2.2 试剂21-22
• 2.3 仪器22-23
• 3 实验方法23-31
• 3.1 小鼠脑组织总蛋白的提取23-24
• 3.2 小鼠脑组织总蛋白的Western blot检测24-25
• 3.2.1 浓度10%聚丙烯酰胺凝胶的配置24
• 3.2.2 Western Blot分析24-25
• 3.3 AD模型小鼠的主动免疫治疗25-26
• 3.4 血清抗体滴度水平测定26
• 3.5 细胞增殖水平测定26-27
• 3.6 小鼠行为学评价27
• 3.7 免疫组化27-28
• 3.8 ELISA定量试剂盒检测脑组织提取液Aβ42与tau蛋白浓度28-29
• 3.9 实时定量PCR29-31
• 3.9.1 引物29
• 3.9.2 RNA的提取与准备29-30
• 3.9.3 cDNA的合成30
• 3.9.4 实时定量PCR30-31
• 4 实验结果31-55
• 4.1 相同月龄的AD模型小鼠与C57BL/6对照小鼠calpain活性和PSD-95蛋白水平比较分析31-40
• 4.1.1 1月龄小鼠脑组织PSD-95与spectrin蛋白水平检测31-32
• 4.1.2 3月龄小鼠脑组织PSD-95与spectrin蛋白水平检测32-33
• 4.1.3 6月龄小鼠脑组织PSD-95与spectrin蛋白水平检测33-34
• 4.1.4 9月龄小鼠脑组织PSD-95与spectrin蛋白水平检测34-35
• 4.1.5 12月龄小鼠脑组织PSD-95与spectrin蛋白水平检测35-36
• 4.1.6 16月龄小鼠脑组织PSD-95与spectrin蛋白水平检测36-37
• 4.1.7 20月龄小鼠脑组织PSD-95与spectrin蛋白水平检测37-38
• 4.1.8 小结38-40
• 4.2 AD模型小鼠calpain活性和PSD-95蛋白及其它突触相关蛋白随月龄变化的动态表达分析40-44
• 4.2.1 野生型C57BL/6小鼠脑组织calpain活性与PSD-95水平随月龄增长的变化分析40-42
• 4.2.2 AD模型小鼠脑组织突触相关蛋白随发病历程的表达变化分析42-43
• 4.2.3 小结43-44
• 4.3 Calpain活性与PSD-95在AD疫苗药效学评价中的应用分析44-55
• 4.3.1 血清抗体滴度水平测定45-46
• 4.3.2 模型小鼠细胞免疫水平测定46-47
• 4.3.3 行为学评价47-48
• 4.3.4 模型小鼠Ap斑块免疫组化48-49
• 4.3.5 模型小鼠脑内Aβ水平变化49-50
• 4.3.6 模型小鼠tau蛋白水平变化50-51
• 4.3.7 模型小鼠免疫治疗后的突触相关蛋白转录水平分析51-52
• 4.3.8 模型小鼠免疫治疗后的突触相关蛋白蛋白水平分析52-53
• 4.3.9 小结53-55
• 5 讨论55-59
• 5.1 Calpain参与AD突触损伤的可能机制55-56
• 5.2 PSD-95参与AD突触损伤的可能机制56-58
• 5.3 突触损伤是参与AD病情发展的主要原因之一58-59
• 6 结论59-61
• 参考文献61-66
• 作者简历及研究成果66-68
• 学位论文数据集68

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