腺苷A1和A2A受体在酒精性肝纤维化大鼠HSC模型中的作用及两者间的相互作用研究

发布时间：2017-09-10 23:31

  本文关键词：腺苷A1和A2A受体在酒精性肝纤维化大鼠HSC模型中的作用及两者间的相互作用研究

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【摘要】：长期酗酒是引起酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)最主要的原因,而酒精性肝纤维化(alcoholic liver fibrosis, ALF)是ALD进展为酒精性肝硬化的中间阶段和必经病理过程。在酒精性肝纤维化的发生发展过程中,乙醇可通过其中间活性代谢产物乙醛激活肝星状细胞O(epatic stellate cell, HSC)。本课题组前期研究证实采用200 gM的乙醛体外刺激HSC细胞48h能成功建立大鼠酒精性肝纤维化HSC细胞模型。腺苷是一种内源性嘌呤核苷酸,广泛分布于机体内,且大多通过作用于细胞膜上的腺苷受体(adenosine receptors, ARs)来发挥相应的生理作用。ARs属G-蛋白偶联受体超家族,可分为4种亚型,即A1R、A2AR、A2BR和A3R。其中A1受体和A2a受体为高表达受体,也是4种ARs中最主要的2种亚型。近年来随着对A1R与A2AR选择性激动剂和拮抗剂的开发,人们对两者作用的多样性研究越来越深入。然而,A1R与A2AR在酒精性肝纤维化HSC中的作用及两者间的相互作用研究尚不清楚。为此,本研究选用离体HSC细胞为研究对象,采用200 μM的乙醛体外刺激HSC细胞48h来模拟大鼠酒精性肝纤维化HSC细胞模型,在模型基础上分别过表达A1R与A2AR,在课题前期研究成果的基础上进一步探讨A1R与A2AR在酒精性肝纤维化中发挥的作用及两者间的相互作用。目的：通过构建真核重组质粒pEGFP-C2-A1R和pEGFP-C2-A2AR,分别瞬时转染HSC细胞,建立A1R与A2AR在HS C细胞中的过表达模型,观察A1R与A2AR的mRNA及其蛋白在HSC细胞中的表达。采用MTT和细胞周期测定实验同时监测相关基因的mRNA和蛋白表达水平,检测A1R与A2AR分别过表达对大鼠酒精性肝纤维化HSC细胞活化增殖的影响,并通过免疫共沉淀技术联合Western Blot方法来研究A1R与A2AR在酒精性肝纤维化HSC细胞中两者间的相互作用。方法：从大鼠脑组织中提取目的基因A1R与A2AR,再用HindIII. KpnI对其分别进行双酶切,并同时双酶切载体pEGFP-C2.酶切产物按常规连接方法进行连接并转化入感受态大肠杆菌DH5a,构建pEGFP-C2-A 1 R与pEGFP-C2-A2AR真核表达质粒。将成功构建的pEGFP-C2-A 1 R与pEGFP-C2-A2AR重组质粒经双酶切鉴定、测序后以脂质体介导转染HSC细胞,于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,运用RT-PCR及Western Blot分别检测A1R与A2AR的mRNA及蛋白的表达情况,以鉴定过表达模型是否建立成功。随后参照课题组前期研究成果采用200μM的乙醛体外刺激HSC细胞48h来建立大鼠酒精性肝纤维化HSC细胞模型,RT-PCR及Western Blot法检测A1R与A2AR分别上调后,目的基因、α-SMA.Collagen Ⅰ和Cyclin-D1的表达变化,同时采用MTT和细胞周期测定实验来检测HSC细胞活化增殖情况。pEGFP-C2-A1R与pEGFP-C2-A2AR真核表达质粒共转染HSC细胞后,利用免疫共沉淀技术检测A1R与A2AR蛋白间的相互作用。结果：1.成功构建过表达模型：经双酶切鉴定可见目的条带,转染重组质粒后可于荧光倒置显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR及Western Blot法可分别检测出A1R和A2AR的mRNA及蛋白表达升高。2.A1R和A2AR分别过表达后对HSC细胞活化增殖的影响：在200 μM的乙醛体外刺激HSC细胞48h的情况下,发现A1R和A2AR分别过表达后,目的基因、α-SMA、Collagen I和Cyclin-D1的表达明显上调。MTT结果表明模型组经200μM乙醛作用48h后能明显促进HSC细胞增殖,过表达组的促进作用更明显。同时细胞周期测定结果显示,模型组经200μM乙醛作用48h后使分布在S期的细胞比例增多,G0/G1期的细胞比例减少。过表达组较模型组相比其分布在S期的细胞比例显著增多,G0/G1期的细胞比例显著减少。这提示A1R和A2AR分别过表达后能促进HSC细胞的活化增殖。3. A1R与A2AR蛋白间的相互作用：利用免疫共沉淀技术联合Western Blot方法,同时选用最后一次的洗涤上清作为阴性对照以消除非特异性蛋白及残留的待测目的蛋白的干扰。Western Blot结果表明,免疫沉淀复合物中能检测到相应的目的蛋白,且免疫印迹中出现的条带与HSC细胞总蛋白中的条带位置一致而阴性对照组未检测出条带,表明A1R蛋白能够与A2AR蛋白通过相互结合来发挥作用。结论：A1R和A2AR对酒精性肝纤维化大鼠HSC的活化增殖具有促进作用,免疫共沉淀证实两者间存在相互作用。
【关键词】：酒精性肝纤维化 腺苷受体 重组质粒 肝星状细胞 活化增殖 免疫共沉淀
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2;R-332
【目录】：

• 英文缩略词5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 1 前言14-15
• 2 实验材料15-17
• 3 实验方法17-30
• 4 实验结果30-41
• 5 讨论41-44
• 6 结论44-45
• 参考文献45-49
• 附录49-51
• 致谢51-52
• 综述52-63
• 参考文献59-63

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本文编号：827313