T细胞衔接活化因子-绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及其在Jurkat细胞的定位

发布时间：2017-09-11 12:32

  本文关键词：T细胞衔接活化因子-绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及其在Jurkat细胞的定位

  更多相关文章： LAT 绿色荧光蛋白 融合蛋白 信号转导 T淋巴细胞

【摘要】：目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与T细胞衔接活化因子(Linker for activated of T cells,LAT)融合蛋白的真核表达载体,观测LAT-EGFP在Jurkat细胞中的定位表达。方法:利用RT-PCR技术提取并扩增LAT除去终止密码子外的全部序列,克隆到真核表达载体PEGFP-N3,酶切鉴定并测序。瞬时转染到Jurkat细胞中进行表达,荧光共聚焦显微镜观察LAT-EGFP在Jurkat细胞中的表达及细胞定位。提取转染后细胞总RNA,通过RT-PCR的方法检测LAT-EGFP在转录水平的表达。利用Western blot法进一步鉴定融合蛋白的表达。结果:重组载体经酶切鉴定,切出片段长度在750 bp左右与插入序列长度相符,并进一步进行测序鉴定证实连接完全正确。共聚焦显微镜观察表达的LAT-EGFP融合蛋白定位在细胞膜上,并呈点簇状聚集状态。RT-PCR扩增证实了LAT和EGFP的融合蛋白在Jurkat细胞中在转录水平的表达,Western blot分析进一步证明了LAT和EGFP融合蛋白构建成功,并在蛋白水平上有明显的融合表达。结论:成功构建真核表达载体LAT-EGFP,且融合蛋白LAT-EGFP与野生型LAT在Jurkat细胞中的定位一致,具有功能表达效应,这为后续准确研究具有棕榈酰化位点的跨膜接头蛋白的信号转导作用提供了一种良好的研究载体和方法。
【作者单位】： 青岛大学医学院免疫学教研室;
【关键词】： LAT 绿色荧光蛋白 融合蛋白 信号转导 T淋巴细胞
【基金】：国家自然科学基金资助项目(No.81273206)
【分类号】：R392.12
【正文快照】： LAT(Linker for activated T cells)最初是从活化的Jurkat T细胞膜成分中提取出来的,其表达具有造血细胞特异性,但仅限于T细胞、NK细胞和肥大细胞[1,2]。B细胞和单核细胞则不表达[3]。LAT在TCR信号传递的过程中起了重要的作用,是一个重要的接头蛋白,在LAT缺陷的细胞中,TCR信号

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张爱红;徐雅飞;王建枝;;β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及表达[J];同济大学学报(医学版);2006年02期

2 赵晓蓉;曹利民;彭吉林;王敏;赵晓平;吴砂;李文涵;叶庆;沈关心;;稳定表达EGFR-GFP融合蛋白细胞系的建立[J];郧阳医学院学报;2006年03期

3 梁爽;于振香;赵丹;杨柯;赵雪俭;杨宝学;;大鼠睾丸AQP8和绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体构建[J];吉林大学学报(医学版);2006年02期

4 邵阳光;李妍;王春玉;佟宇鑫;李丰;;胃癌细胞中p21活化激酶4的表达和定位[J];中国医科大学学报;2009年08期

5 姚丽娟;罗以勤;孔建新;赵亮;濮跃晨;马筱玲;;Tumstatin-EGFP在CHO细胞中的表达和活性分析[J];安徽医科大学学报;2008年06期

6 孙义敏,尹丙姣,李卓娅,姜小丹,徐勇;重组绿色荧光蛋白-肿瘤坏死因子融合蛋白的表达及应用[J];华中科技大学学报(医学版);2004年05期

7 李正赫,田旺,杨文博,白钢;绿色荧光蛋白干扰素-α2b融合基因的构建与表达[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年07期

8 李毓雯;朱传龙;宁琴;罗小平;;小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达[J];医学研究生学报;2007年01期

9 熊锐华;王昊亮;邹丽云;李景怡;张晋宇;张荣华;万瑛;;β2M-绿色荧光蛋白在MHC-Ⅰ肽亲和力实验中的应用[J];免疫学杂志;2009年04期

10 李佳慧,李铁,桑建利;鼠PS1-GFP融合蛋白表达载体的构建研究[J];中国实验动物学报;2005年S1期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 垢敬;;Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

2 李妍;邵阳光;李丰;;PAK4原核和真核表达载体的构建表达及亚细胞定位[A];中国细胞生物学学会第九次会员代表大会暨青年学术大会论文摘要集[C];2007年

3 傅建新;白霞;阮长耿;;绿色荧光蛋白-去整合素融合蛋白的基因构建及高效表达研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

4 李朝军;吕品;蒲咏;张东才;;利用绿色荧光蛋白基因标记技术研究钙调蛋白在HeLa细胞胞质分裂时的动态分布[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年

5 苏晓瑜;吕媛婧;刘虹辰;阮铮;王学锋;陈赛娟;奚晓东;;整合素β3胞浆段末端序列在双向信号转导中的作用及其机制[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年

6 张红;李姣;王丽;席俊;;鸡免疫球蛋白λ轻链绿色荧光蛋白重组分子在COS7细胞的分泌表达[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年

7 沈恂;;绿色荧光蛋白掀开了生命科学研究的新篇章:“绿色革命”[A];第六届全国光生物学学术研讨会论文集[C];2004年

8 梁赤周;马志章;丁鸣;杨帆;丁仁瑞;;γTNF-β与TNF-β对L929细胞的细胞毒作用及其信号转导的初步研究[A];第七届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2001年

9 李琪;梁燕;张晶晶;冯利杰;王海萍;沈玉先;;tau蛋白的直接细胞毒作用[A];2007年全国药物毒理学会议论文集[C];2007年

10 袁顺宗;谭江琳;马兵;彭旭;贺伟峰;黄正根;程文广;贾雄飞;王晓娟;胡婕;甘成军;陈希炜;胡晓红;张小容;罗高兴;吴军;;激光共聚焦技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 ;“绿色荧光蛋白”能追踪癌细胞[N];江苏科技报;2008年

2 ;化学诺奖得主为什么是钱永健[N];江苏科技报;2008年

3 ;生物光的真谛：绿色荧光蛋白[N];大众科技报;2008年

4 记者 朱敏丽　通讯员 潘越;中国医药城首批融合蛋白试剂出口[N];泰州日报;2010年

5 金陵;融合蛋白试剂首次出口美国[N];中国医药报;2010年

6 吴红梅;我省首批融合蛋白试剂出口美国[N];新华日报;2010年

7 李岿然 尹志 李丽云;绿色荧光蛋白“转基因”猪问世[N];江苏农业科技报;2007年

8 李岿然 尹志 记者　李丽云;国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪问世[N];科技日报;2006年

9 记者　朱伟光 特约记者 朱伟华 通讯员　鞠长荣 岳金凤;哈医大四院推出绿色荧光蛋白活体成像系统[N];光明日报;2006年

10 陈清华;从“绿色荧光蛋白”所想到的[N];中国财经报;2008年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 徐越驰;组氨酸为活性中心的蛋白质酪氨酸磷酸酶和细胞自噬标记物的研究[D];吉林大学;2010年

2 王小中;诱骗寡核苷酸靶向阻断STAT5逆转白血病K562细胞恶性表型[D];重庆医科大学;2005年

3 孟巧红;家蚕表达的绿色荧光蛋白标记的霍乱毒素B亚基与人胰岛素融合蛋白抗1型糖尿病的研究[D];浙江大学;2011年

4 何飞;Notch-Deltal对人牙髓干细胞增殖及分化影响的实验研究[D];第四军医大学;2004年

5 柏亚铎;犬瘟热病毒、犬冠状病毒入侵宿主细胞机制研究[D];中国农业大学;2005年

6 郑祥毅;PI3K/Akt信号通路在肾缺血再灌注损伤中的调控作用[D];浙江大学;2005年

7 陈旭红;大鼠脑纹状体边缘区参与学习记忆的分子机制的研究[D];第一军医大学;2005年

8 万晶宏;促凋亡蛋白（BclGs）的信号转导机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年

9 郝嘉;Pyk_2在心肌间质纤维化中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2006年

10 刘联;E-钙粘素介导的细胞黏附对卵巢癌细胞表皮生长因子受体（EGFR）的激活及其信号转导[D];山东大学;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王耀晟;表达hVEGF_（121）/EGFP的间充质干细胞制备及缺氧对其表达影响[D];南昌大学;2007年

2 韩雪松;应用m_2 AchR-Gilα融合蛋白鉴别m_2 AchR的特异性配体[D];中国医科大学;2004年

3 刘少宁;VP3基因对胃癌细胞SGC7901的作用和蛋白质组的研究[D];重庆医科大学;2009年

4 张敬梅;一株分泌猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备与鉴定[D];安徽农业大学;2009年

5 阴继凯;PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对肝细胞肿瘤杀伤作用的研究[D];第四军医大学;2004年

6 潘飞燕;基于甾类激素信号转导的药物筛选模型的建立[D];南京师范大学;2005年

7 范春妹;肝癌特异性黏附肽—GFP融合蛋白的构建，，表达及活性鉴定[D];华东师范大学;2005年

8 陈U

本文编号：830748