Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白真核表达纯化及其活性的初步研究

发布时间：2017-09-11 16:01

  本文关键词：Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白真核表达纯化及其活性的初步研究

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【摘要】：Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类在机体固有免疫和获得性免疫中发挥重要作用的模式识别受体,能够特异性识别细菌、病毒等病原体相关分子模式。目前在哺乳动物细胞中已经发现了13种TLR,其中人TLRs家族有11种。TLR5作为TLRs家族中的一个成员,能够通过特异性识别细菌鞭毛蛋白,激活固有免疫应答。TLR5广泛地分布于哺乳动物气管、脾脏、肺、肝脏、肾脏、泌尿生殖道等的上皮细胞和树突状细胞的细胞膜上。当TLR5特异性识别鞭毛蛋白,其胞内结构域会发生构象变化,形成同源二聚体,并开始下游的信号转导。TLR5信号通路主要是My D88依赖性的,最终激活NF-κB、JNK和p38,诱导免疫炎症相关基因的转录翻译,促进细胞因子的分泌。TLR5激动剂CBLB502是由克利夫兰生物实验室研究开发的来源于沙门氏菌鞭毛蛋白改构的蛋白药物。经过结构优化设计后,CBLB502缺失了鞭毛蛋白具有高度免疫原性的中心球状结构域,包含了鞭毛蛋白N端和C端的功能结构域,比鞭毛蛋白具有更低的免疫原性,但保留了激活TLR5的能力和抗辐射的功能。研究发现,CBLB502具有缓解修复辐射或化学药物引起的造血系统和胃肠道损伤,但其组织保护作用不会延伸至肿瘤。另外它对表达TLR5的肿瘤细胞具有直接细胞毒作用,并能动员免疫细胞至肝脏对肝转移癌产生抗肿瘤作用。目前研究中所使用到的CBLB502均是由大肠杆菌表达纯化。原核表达系统虽能够高效地表达目的蛋白,但是常以包涵体形式存在,需变性复性处理后进行分离纯化,且内毒素及热源不易除去,分离纯化工艺较为复杂。因此,本课题拟利用真核表达获得CBLB502与Ig G1 Fc片段的融合蛋白,以克服CBLB502原核表达的缺点,并且带来Fc融合蛋白的优点。CBLB502与Ig G1 Fc片段融合后,能够简化分离纯化工艺。另外,融合Fc片段可以增大蛋白分子量,并且在新生的Fc受体的保护下,可以延长其血浆半衰期。并且Fc融合蛋白可以通过二硫键形成稳定的二聚体,能够提高蛋白分子的稳定性。首先需要进行CBLB502-Fc真核表达载体的构建。根据文献报道中CBLB502的基因序列,优化合成适宜在中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary,CHO-S)翻译表达的基因序列。经PCR扩增CBLB502基因片段后,使用限制性内切酶Avr II、Bam H I双酶切目的基因片段,克隆至p UC57-Fc质粒中。然后使用Eco R V、Hind III双酶切pc DNA3.1和p UC57-CBLB502-Fc,将CBLB502-Fc基因片段克隆至载体pc DNA3.1,挑选阳性克隆并测序,再将重组质粒转染至CHO-S细胞,筛选高表达细胞系,并用ELISA检测和免疫印迹鉴定表达情况。扩大培养后收集培养上清,利用Protein A亲和柱纯化目的蛋白,再对目的蛋白进行SDSPAGE鉴定。最终成功构建得到了CBLB502-Fc真核表达载体。转染CHO-S细胞后,筛选得到CBLB502-Fc高表达细胞系,并且纯化得到较高纯度的融合蛋白,为后续CBLB502-Fc的生物学功能研究奠定了基础。然后设计实验对CBLB502-Fc融合蛋白体内外活性进行了初步鉴定。通过检测NF-κB核易位和JNK磷酸化,初步鉴定CBLB502-Fc的体外活性。利用20μg/m L CBLB502-Fc、20ng/m L的TNF-α(阳性对照)、10μg/m L CBLB502(阳性对照)和刺激经饥饿处理的A549细胞20 min,收集细胞进行细胞核质蛋白分离实验,western blot检测核质分离情况和NF-κB核易位,同时进行细胞免疫荧光实验观察NF-κB核易位情况。结果显示,核质分离成功后,CBLB502-Fc不能激活NF-κB信号通路,免疫荧光结果与western blot结果一致。再利用上述相同实验条件对A549细胞进行刺激,使用RIPA细胞裂解液裂解细胞,收集蛋白,进行western blot检测JNK磷酸化水平的变化。结果显示,CBLB502-Fc同CBLB502一样都能够激活TLR5信号通路,然后激活JNK,提高其磷酸化水平。体内活性实验则是使用C57BL/6小鼠进行辐射存活实验。在小鼠接受辐射前30min,腹腔注射给药,分别注射生理盐水、CBLB502(剂量为0.2mg/kg)、CBLB502-Fc低剂量(剂量为0.2mg/kg)和CBLB502-Fc高剂量(剂量为0.4mg/kg)。使用60Co-γ射线对小鼠进行8 Gy全身辐照,照射后,对小鼠进行30天的存活观察。结果表明,CBLB502-Fc能够显著提高致死辐照的小鼠的存活率,且与CBLB502之间无显著性差异。另外在小鼠地西他滨(Decitabine,DAC)急性毒性实验中,CBLB502-Fc与CBLB502均能够显著延长小鼠存活时间。以上两个小鼠存活实验初步证明了CBLB502-Fc具有体内生物学活性,对机体具有辐射保护作用和降低化药的毒副作用。再结合体外细胞实验结果,JNK信号通路可能在CBLB502与CBLB502-Fc生物学功能的发挥中起到重要作用。最后利用DAC建立小鼠骨髓抑制模型,研究CBLB502-Fc对于化药引起的骨髓抑制的缓解作用以及对于小鼠的细胞表型的影响。将48只BALB/c小鼠随机分为对照组、CBLB502组、CBLB502-Fc组、DAC组、DAC+CBLB502组、DAC+CBLB502-Fc组。按组对小鼠小鼠腹腔注射剂量为1 mg/kg的DAC,连续给药3天。最后一次DAC给药1 h后,按组注射生理盐水、CBLB502(剂量为0.1 mg/kg)与CBLB502-Fc(剂量为0.2 mg/kg)。停止给药3天后,重复一个给药过程。解剖前一天,割小鼠尾静脉取血检测外周血象。最后对小鼠摘眼球取血,解剖取股骨骨髓。小鼠血液与骨髓样品加入荧光标记单克隆抗体进行标记,再使用红细胞裂解液裂解红细胞,处理好的样品进行流式细胞术分析。外周血象检测结果显示,经过DAC处理的小鼠外周血象各项指标都显著低于对照组的小鼠,表明成功建立了骨髓抑制小鼠模型。而CBLB502-Fc与CBLB502不能够缓解DAC对于红细胞、白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的抑制。但CBLB502-Fc能够显著缓解DAC对外周血血小板的抑制。这表示CBLB502-Fc对于骨髓抑制具有一定的缓解作用。另外,CBLB502与CBLB502-Fc能够显著促进中性粒细胞的增殖。流式检测发现,相比对照小鼠,DAC给药后的骨髓抑制小鼠外周血与骨髓CD4+、CD8a+、CD4+/CD8a+T淋巴细胞和CD3e+、NK、NKT细胞均显著升高,而CD11b+细胞显著下降。CBLB502与CBLB502-Fc都能够显著降低小鼠外周血CD4+、CD8a+、CD4+/CD8a+T淋巴细胞,显著升高外周血与骨髓中CD11b+细胞,另外能够升高外周血中NK与NKT细胞。对于骨髓抑制小鼠,CBLB502与CBLB502-Fc能够显著升高外周血中CD4+T淋巴细胞,降低外周血NK与NKT细胞,而对CD11b+细胞无明显作用。另外CBLB502显著升高骨髓抑制小鼠骨髓中NK与NKT细胞,而CBLB502-Fc能够显著降低骨髓抑制小鼠骨髓中CD4+、CD4+/CD8a+T淋巴细胞。结果表明CBLB502-Fc对于小鼠CD4+和CD8a+细胞、NK与NKT细胞和CD11b+细胞的影响与CBLB502相一致,都能够使机体产生固有免疫应答,促进NK细胞、NKT细胞和CD11b+细胞的增殖。综上所述,初步证明了CBLB502-Fc是具有与CBLB502相同生物学活性的融合蛋白,具有辐射防护作用和骨髓保护作用。而CBLB502-Fc作用的信号通路及其功能机制值得进一步的研究与探讨。
【关键词】：Toll样受体5 CBLB502-Fc 融合蛋白 骨髓抑制 抗辐射
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略词表6-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-21
• 1. TLR5的蛋白结构及分布15-16
• 2. TLR5的信号通路16-17
• 3. TLR5生理功能的研究17-18
• 4. TLR5激动剂18
• 5. 鞭毛蛋白衍生物CBLB50218-21
• 第一部分 CBLB502-Fc 真核表达载体的构建、表达与纯化21-36
• 1. 实验材料、试剂和仪器设备21-24
• 1.1 质粒、感受态和细胞株21
• 1.2 主要试剂及耗材21-22
• 1.3 主要试剂配制22-23
• 1.4 主要仪器设备23-24
• 2. 方法24-29
• 2.1 CBLB502目的基因的获得24
• 2.2 pcDNA3.1-CBLB502-Fc真核表达载体的构建24-26
• 2.3 重组质粒转染CHO-S细胞26
• 2.4 表达CBLB502-Fc的CHO-S细胞的单克隆筛选及WB验证26-27
• 2.5 CBLB502-Fc融合蛋白的表达纯化27-28
• 2.6 SDS-PAGE检测目的蛋白及考马斯亮蓝快速染色28-29
• 3. 结果29-33
• 3.1 CBLB502目的基因的优化合成29-30
• 3.2 pcDNA3.1-CBLB502-Fc质粒的构建30-31
• 3.3 pcDNA3.1-CBLB502-Fc质粒转染CHO-S细胞31
• 3.4 阳性细胞克隆的筛选和WB验证31-32
• 3.5 Protein A亲和柱纯化目的蛋白32-33
• 3.6 目的蛋白的SDS-PAGE鉴定及考马斯亮蓝染色结果33
• 4 讨论与分析33-35
• 5. 小结35-36
• 第二部分 CBLB502-Fc融合蛋白体内外活性的初步鉴定36-45
• 1. 实验动物、材料与试剂36-37
• 1.1 细胞株和动物36
• 1.2 主要试剂及耗材36-37
• 2. 方法37-39
• 2.1 CBLB502-Fc激活TLR5-NF-κB信号通路的研究37-38
• 2.2 检测CBLB502-Fc对JNK激活情况38
• 2.3 CBLB502-Fc对小鼠辐射防护作用的研究38-39
• 2.4 CBLB502-Fc对注射高剂量DAC的小鼠存活率的影响39
• 2.5 统计学分析39
• 3. 结果39-42
• 3.1 CBLB502-Fc不激活NF-κB信号通路39-41
• 3.2 CBLB502-Fc提高JNK的磷酸化水平41
• 3.3 CBLB502-Fc显著提高 γ 射线照射后小鼠的生存率41-42
• 3.4 CBLB502-Fc延长注射高剂量DAC的小鼠存活时间42
• 4. 讨论与分析42-44
• 5. 小结44-45
• 第三部分 CBLB502-Fc缓解骨髓抑制的初步研究45-56
• 1. 实验动物、材料和试剂45
• 1.1 动物45
• 1.2 主要试剂及耗材45
• 1.3 主要试剂配制45
• 2. 方法45-46
• 2.1 CBLB502-Fc影响小鼠骨髓抑制的初步动物实验及外周血象检测45-46
• 2.2 小鼠外周血与骨髓进行流式细胞分析46
• 2.3 统计与分析46
• 3. 结果46-52
• 3.1 CBLB502-Fc对于普通和骨髓抑制小鼠外周血象的影响46-47
• 3.2 小鼠外周血与骨髓的流式细胞分析的结果47-52
• 4. 讨论与分析52-55
• 5. 小结55-56
• 结论56-57
• 参考文献57-61
• 附录61-62
• 个人简历62-63
• 致谢63

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