骨密质碎片法分离培养小鼠间充质干细胞及其生物学特性鉴定

发布时间：2017-09-15 00:27

  本文关键词：骨密质碎片法分离培养小鼠间充质干细胞及其生物学特性鉴定

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【摘要】：目的:建立一种从小鼠骨密质中分离培养间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的高效方法,并证实骨密质来源MSCs具有成骨、成脂肪和成软骨的多向分化能力。方法:采取骨片法从C57BL/6小鼠骨密质中分离和纯化MSCs,荧光倒置显微镜下直接观察不同生长时期MSCs形态学特征;流式细胞术(Flow cytometry,FCM)对其进行免疫表型鉴定;取第5代MSCs进行成骨、成脂肪和成软骨定向诱导并作组织化学染色鉴定,RT-PCR方法检测定向诱导后特异性基因表达:骨特异性的骨钙素(Osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)基因,脂肪特异性的脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LP)和脂肪酶(Adipsin)基因,软骨特异性的Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)基因。结果:接种骨密质碎片约24小时后即可见短梭状细胞从骨碎片向周围爬出,呈贴壁生长,经3次传代后即可获得细胞形态均一、贴壁能力强、易于消化的梭形MSCs。第5代C57BL/6小鼠MSCs阳性表达CD44(99.81%)、CD29(99.77%)、Sca-1(99.76%)和CD34(94.51%),阴性表达CD45(0.86%)和CD117(0.17%)。第5代MSCs经诱导后可成功的分化为骨、脂肪和软骨细胞,相应茜素红、油红O和阿利辛蓝染色成阳性,并分别表达骨特异性骨钙素(Osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)基因,脂肪特异性脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LP)和脂肪酶(Adipsin)基因,软骨特异性Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)基因。结论:经骨密质碎片法培养可以在较短时间内分离出更高纯度的MSCs,该方法操作简单、经济,稳定性好,分离效率高,可重复性强。培养出的MSCs符合公认的标准(具有塑料粘附、特定的免疫表型和多向分化潜能)。
【作者单位】： 北京大学第一医院血液科;
【关键词】： 间充质干细胞 骨密质 细胞培养 鉴定 多向分化
【基金】：国家自然科学基金资助项目(No.30940030,81070448)
【分类号】：R329
【正文快照】： 小鼠是研究MSCs生物学特征的理想模型,然而小鼠MSCs的分离与大鼠和其它物种相比要困难很多。不同品系小鼠在相同培养条件下,其粘附、增殖和分化能力也不尽相同[1]。常规的全骨髓贴壁和密度梯度离心等方法分离获得的小鼠MSCs不仅含量很低,而且纯度不够,难以满足实验研究的要求

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本文编号：853252