肠炎沙门菌sopE2与sptP基因缺失株的构建及其免疫生物学研究

发布时间：2017-09-15 04:21

  本文关键词：肠炎沙门菌sopE2与sptP基因缺失株的构建及其免疫生物学研究

  更多相关文章： 肠炎沙门菌 sptP基因 同源重组 免疫生物学特性

【摘要】：肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis, S. Enteritidis, SE)是革兰阴性兼性胞内寄生菌,主要寄生在人和动物的肠道中,能引起畜禽及人类的沙门菌病,具有重要的公共卫生意义。疫苗接种是目前控制人和动物沙门菌病的有效措施之一。由SPI-1和SPI-2编码的Ⅲ型分泌系统(type III secretion/translocation system, T3SS)是沙门菌致病的重要毒力因子,近年来通过基因工程技术,将病原菌相关毒力基因敲除,构建沙门菌减毒活疫苗的研究备受关注。但是,目前以T3SS SPI-1编码的效应蛋白基因sopE2和sptP作为沙门菌减毒的靶基因研究还未见报道。本研究分别将肠炎沙门菌C50336株SPI-1 T3SS毒力相关基因敲除,构建了基因缺失株C50336ΔsopE2和C50336ΔsptP,对其生物学特性进行了鉴定,并且对缺失株C50336Asp/P的免疫生物学特性做了评价。一、肠炎沙门菌sopE2与sptP基因缺失株的构建及其生物学特性鉴定利用分子生物学技术构建了重组原核表达质粒pET30a-SopE2, pET32a-SptP,导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3),通过IPTG诱导,成功表达了重组蛋白rHis-SopE2、rHis-SptP, SDS-PAGE显示重组蛋白均以可溶性的形式表达,以纯化后的两种重组蛋白分别制备了多克隆抗体。利用λ-Red同源重组系统对肠炎沙门菌sopE2与sptP基因进行敲除,成功构建了肠炎沙门菌缺失株C50336△sopE2和C50336△sptP,并通过重组质粒PBR322成功构建回复株C50336△sopE2::sopE2和C50336△sptP::sptP。Real time-PCR与Western blotting分析结果均表明基因缺失与回复成功。对两株缺失株的生长、生化特性以及对小鼠的毒力鉴定。结果表明,两缺失株生长和生化特性与野生株无显著差异：C50336AsopE2对小鼠的LD50与野生株相比没有显著变化,而C50336△sptP比野生株的LDso至少升高100倍,这为后期研究其作为减毒肠炎沙门菌活疫苗的可能性奠定了重要基础。二、肠炎沙门菌C50336△sptP的免疫生物学特性研究以鼠源巨噬细胞RAW264.7和人源结肠癌上皮细胞Caco-2为细胞模型,比较缺失株C50336AsptP与野生株C50336的黏附、侵袭和增殖能力。结果发现,与野生株相比,该缺失株对RAW264.7细胞的侵袭和早期增殖能力均显著下降(p0.05)；同时,缺失株对Caco-2上皮细胞的侵袭能力也显著弱于野生株(p0.05)。为评价C50336AsptP减毒后的安全性,以剂量为1×107 CFU和1×108 CFUC50336 AsptP分别免疫小鼠,连续观察21天,测定其在小鼠肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结(mLN)、盲肠及粪便内的定植情况。研究发现在免疫后的21天,1×107CFU免疫组小鼠各脏器中的细菌均已基本被清除；1×108CFU免疫组仅有1只小鼠肝脏、脾脏、mLN中仍携带有少量细菌。所有免疫后的小鼠从第3天开始直至21天盲肠与粪便中均已无细菌的定植。同时,从免疫后小鼠体重增长的监测结果显来看,缺失株的免疫对小鼠体重的增长没有显著影响。为进一步测定缺失株在小鼠体内引起的免疫应答规律,以剂量为1×107CFU和1×108CFUC50336△sptP分别对小鼠进行免疫并在两周后二免,对照组用PBS以相同方式进行免疫,检测血清IgG抗体和亚型分泌水平以及淋巴细胞的增殖效果。结果显示缺失株免疫后能诱导小鼠产生良好的体液免疫应答和细胞免疫应答。以野生株C50336对二免后两周的小鼠进行攻毒,以评价C50336AsptP对小鼠的免疫保护。结果显示强毒株攻毒后1×108 CFU免疫组的免疫保护率为100%,1×107CFU免疫组的免疫保护效率为62.5%,而对照组仅为25%。同时,通过对攻毒后存活小鼠的肝脏、脾脏及盲肠中细菌分离情况发现免疫组大部分小鼠体内已基本不带菌,而对照组的小鼠体内仍携带大量细菌。这说明免疫了C50336AsptP后能有助于小鼠对强毒株的清除。
【关键词】：肠炎沙门菌 sptP基因 同源重组 免疫生物学特性
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61;R378
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 符号说明8-9
• 综述 沙门菌T3SS相关致病机制及其防治研究进展9-21
• 1 沙门菌9-10
• 1.1 沙门菌病原学与流行病学9
• 1.2 沙门菌的传播途径9-10
• 2 T3SS相关效应蛋白在沙门菌感染各阶段的功能10-14
• 2.1 依赖SPI-1 T3SS的侵袭过程10-11
• 2.2 沙门菌效应蛋白介导SCV的形成11-12
• 2.3 沙门菌效应蛋白诱导的肠道炎症反应与细胞调亡12-14
• 3 沙门菌病的防治14-16
• 3.1 特异性的免疫预防14-16
• 3.2 检疫净化措施16
• 4 结语16-17
• 参考文献17-21
• 第一章 肠炎沙门菌sopE2与sptP基因缺失株的构建及其生物学特性鉴定21-43
• 1 材料21-23
• 1.1 菌株和质粒21-22
• 1.2 主要试剂22
• 1.3 主要仪器22
• 1.4 实验动物与细胞22-23
• 1.5 引物设计23
• 2 方法23-33
• 2.1 肠炎沙门菌效应蛋白的原核表达23-26
• 2.2 肠炎沙门菌基因缺失株的构建26-28
• 2.3 回复株的构建28
• 2.4 缺失株与回复株对应基因表达情况检测28-30
• 2.5 肠炎沙门菌缺失株生物学特性鉴定30-32
• 2.6 统计学分析32-33
• 3 结果33-40
• 3.1 肠炎沙门菌SopE2与SptP蛋白原核表达及鉴定33-35
• 3.2 肠炎沙门菌缺失株及回复株的构建与鉴定35-37
• 3.3 肠炎沙门菌缺失株目的基因和蛋白的体外情况测定37-38
• 3.4 肠炎沙门菌缺失株生物学特性鉴定38-40
• 4 讨论40-41
• 参考文献41-43
• 第二章 肠炎沙门菌C50336△sptP的免疫生物学特性研究43-57
• 1 材料43-44
• 1.1 实验动物与细胞系43
• 1.2 主要试剂43-44
• 2 方法44-47
• 2.1 肠炎沙门菌sptP缺失株对细胞的感染实验44-45
• 2.2 C50336△sptP对小鼠的安全性实验45
• 2.3 C50336△sptP对小鼠的免疫应答规律测定45-47
• 2.4 免疫保护效力试验47
• 3 结果47-52
• 3.1 肠炎沙门菌sptP缺失株对细胞的感染实验47-49
• 3.2 C50336sptP对小鼠的安全性实验结果49-50
• 3.3 C50336△sptP对小鼠免疫应答规律的测定结果50-51
• 3.4 免疫保护效力测定结果51-52
• 4 讨论52-55
• 参考文献55-57
• 致谢57-58
• 攻读硕士学位期间发表论文目录58-59

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨劲松;陈爱平;陈建辉;徐海滨;郑金凤;严延生;;2009～2010年福建省分离自沙门菌病患者的肠炎沙门菌分子特征研究[J];预防医学论坛;2013年04期

2 储从家,孔繁林,李克光,杨庆文,罗次节,张艳;从胆汁中检出肠炎沙门菌1例[J];临床检验杂志;1997年05期

3 邓志爱;侯水平;张颖;张欣强;庞杏林;胡肖娟;夏丹;;不同来源肠炎沙门菌的溯源研究[J];中国卫生检验杂志;2012年09期

4 鲁学萍;杜惠芬;李克生;连晓雯;刘红亮;袁明;叶文华;;肠炎沙门菌脂多糖抗原的制备及其生物学特性[J];中国生物制品学杂志;2011年07期

5 姚丰华;张钰;朱国强;;肠炎沙门菌hcp基因缺失株的体内致病性研究[J];扬州大学学报(农业与生命科学版);2014年02期

6 姚丰华;张钰;朱国强;;肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因缺失株的毒力相关功能研究[J];中国兽医学报;2014年06期

7 姚丰华;张钰;朱国强;;肠炎沙门菌SPI-19编码的hcp基因的克隆、表达及多抗制备[J];中国家禽;2014年10期

8 邓显文;谢芝勋;刘加波;谢志勤;庞耀珊;谢丽基;范晴;罗思思;;肠炎沙门菌fliC蛋白的表达及ELISA检测方法的建立[J];动物医学进展;2013年06期

9 刘雯静;邱少富;王勇;王中强;陈琛;李婧;张伶;杜昕颖;汪舟佳;薛文仲;黄留玉;宋宏彬;刘雪林;;肠炎沙门菌临床分离株耐药性与耐药基因分析[J];中国公共卫生;2010年12期

10 厚华艳;朱春红;吕靖;董立伟;朱国强;;肠炎沙门菌SEF14菌毛与肠上皮细胞IPEC-J2和Caco-2的体外黏附作用研究[J];畜牧与兽医;2013年09期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 李燕俊;计融;王玉平;江涛;崔生辉;刘秀梅;;肠炎沙门菌多位点序列分型技术的研究[A];达能营养中心青年科学工作者论坛优秀论文集2008年第1期[C];2008年

2 潘丹妮;刘勇;;肠炎沙门菌对喹诺酮类药物耐药性及耐药机制研究[A];第一次全国中西医结合检验医学学术会议暨中国中西医结合学会检验医学专业委员会成立大会论文汇编[C];2014年

3 张丽娟;;肠炎沙门菌致小腿脓肿一例[A];第一次全国中西医结合检验医学学术会议暨中国中西医结合学会检验医学专业委员会成立大会论文汇编[C];2014年

4 王琳娜;;由肠炎沙门菌引起的食物中毒[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 姚丰华;肠炎沙门菌溶血素共调节蛋白hcp基因及其致病性相关研究[D];扬州大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前8条

1 陶明新;肠炎沙门菌sipA缺失株的构建及SipA蛋白促炎效应初步研究[D];扬州大学;2016年

2 汤佩佩;肠炎沙门菌sopE2与sptP基因缺失株的构建及其免疫生物学研究[D];扬州大学;2016年

3 刘谢;广东省2007-2013年肠炎沙门菌耐药特征和分子分型研究[D];南方医科大学;2015年

4 陈静;利用SCOTS技术筛选肠炎沙门菌在不同源巨噬细胞内的转录序列[D];扬州大学;2013年

5 刘志成;利用IVIAT筛选肠炎沙门菌体内感染相关因子[D];扬州大学;2011年

6 王勇祥;肠炎沙门菌和雏沙门菌fimH基因缺失株的构建及相关功能性分析[D];扬州大学;2015年

7 王晓春;肠炎沙门菌lpfC和stdB基因缺失株的构建及其相关功能的初步研究[D];扬州大学;2015年

8 吴颖斐;肠炎沙门菌LPS合成相关基因rfaQ缺失株的构建及其毒力研究[D];扬州大学;2015年

，

本文编号：854281