日本血吸虫Vasa3基因定位与功能的初步研究

发布时间：2017-09-19 17:15

  本文关键词：日本血吸虫Vasa3基因定位与功能的初步研究

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【摘要】：目的:利用原位杂交技术对日本血吸虫各期虫体进行整虫基因定位,初步判断Vasa3在日本血吸虫生殖系统发育中的作用;应用RNA干扰技术揭示Vasa3基因在血吸虫生殖、发育中所具有的功能;通过本研究期望发现可干预和抑制血吸虫生殖发育的关键靶标,为研发抑制血吸虫虫卵发育及活性的药物或制剂提供理论和实验依据,探索控制血吸虫病流行和减轻血吸虫对人体危害新途径。方法:利用BLAST软件,筛选特异性序列作为Vasa3基因原位杂交RNA探针片段,以血吸虫成虫cDNA为模板,普通PCR扩增获得314 bp特异性片段,重组到pspT-18载体,体外转录合成地高辛反义RNA探针。对日本血吸虫24、36、及42天成虫通过漂白、透膜、杂交、显色等处理后,封片观察。以Vasa3为靶基因,合成3个不同靶区域的siRNA(V1,V2和V3),实验结果确定有效靶点后,构建包装表达shRNA的逆转录病毒的质粒载体,与PVSVG质粒共转染GP2-293细胞后,48h收取细胞上清,通过超速离心法浓缩病毒,Retro-X qRT-PCR Titration Kit进行病毒滴定。用针对日本血吸虫Vasa3 shRNA的病毒感染日本血吸虫18天成虫,分别在RNA干扰后7天观察Vasa3基因及蛋白表达水平,于14天通过激光共聚焦显微镜观察生殖系统形态学变化。结果:通过整虫原位杂交,在日本血吸虫24、36及42天雌虫卵巢和卵黄腺可见强烈杂交阳性信号,在雄虫中未见明显阳性信号,由此结果显示Vasa3基因在雌虫卵巢和卵黄腺高表达。siRNA筛选结果显示V2组靶序列(5’-cuaaacgcggagcugauautt-3’)具有较好的干扰效果,以此序列成功构建含人U6启动子的逆转录病毒表达载体PLNHX_HsU6_Vasa3。与PVSVG质粒共转染GP2-293细胞后,成功包装逆转录病毒并测定滴度为5×107cfu/ml。感染日本血吸虫后RT-PCR显示Vasa3基因水平较对照组下降69%。激光共聚焦显微镜观察虫体生殖系统形态结果显示与对照组相比,实验组雄虫睾丸变小,包膜不规整,睾丸内细胞形态杂乱,分界不清。雄虫卵巢内细胞减少,细胞分界不清,结构紊乱。结论:本课题首先通过Vasa3在生殖系统定位的明确,初步证实Vasa3可能参与血吸虫雌虫生殖器官的发育并可做为雌性生殖系统的分子标志。再通过小RNA分子干扰技术,体外验证消减该基因表达的靶标区域。最后将Vasa3干扰有效靶标区域整合入表达发夹RNA的逆转录病毒,用该病毒感染血吸虫,达到能较长期抑制Vasa3基因的表达,明确该基因在血吸虫生殖系统发育中的功能。通过对Vasa3基因的研究,有助于探索控制血吸虫病流行和减轻血吸虫对人体危害的新途径。此方法为长效抑制日本血吸虫的基因表达、鉴定其功能提供一种可靠的方法。
【关键词】：日本血吸虫 Vasa3基因 基因定位 RNA干扰
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R383.2
【目录】：

• 中英文缩略词对照表7-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 1 前言12-15
• 2 材料与方法15-32
• 2.1 材料15-19
• 2.1.1 主要软件15
• 2.1.2 菌株、质粒和细胞15
• 2.1.3 实验动物15
• 2.1.4 主要试剂及试剂盒15-16
• 2.1.5 部分试剂的配置方法16-18
• 2.1.6 主要仪器18-19
• 2.2 实验方法19-32
• 2.2.1 Sj Vasa3基因整虫原位杂交19-24
• 2.2.1.1 Sj Vasa3基因特异性片段获取19-20
• 2.2.1.2 psp T-19+Sj Vasa3重组质粒的构建与鉴定20
• 2.2.1.3 体外转录制备DIG-m RNA探针20-21
• 2.2.1.4 单酶切使模板线性化21-22
• 2.2.1.5 合成探针22
• 2.2.1.6 日本血吸虫整虫原位杂交22-24
• 2.2.2 si RNA干扰筛选消减Sj Vasa3基因表达的有效片段24-26
• 2.2.2.1 从三个si RNA中筛选最佳片段24
• 2.2.2.2 si RNA干扰18天成虫24-25
• 2.2.2.3 RT-PCR检测si RNA干扰效果25-26
• 2.2.3 表达Sj Vasa sh RNA逆转录病毒的包装及滴度测定26-31
• 2.2.3.1 构建Sj Vasa3 sh RNA表达质粒26-28
• 2.2.3.2 GP2-293细胞培养28-29
• 2.2.3.3 逆转录病毒的包装29-31
• 2.2.3.4 病毒滴定31
• 2.2.4 逆转录病毒感染日本血吸虫31
• 2.2.4.1 逆转录病毒感染18天成虫31
• 2.2.5 逆转录病毒干扰效果测定31-32
• 2.2.5.1 荧光定量检测Sj Vasa3基因表达水平31
• 2.2.5.2 激光共聚焦显微镜观察日本血吸虫成虫生殖系统形态学变化31-32
• 3 实验结果32-42
• 3.1 Sj Vasa3的命名32-33
• 3.2 原位杂交实验结果33-39
• 3.2.1 体外转录合成DIG-RNA探针33-34
• 3.2.2 日本血吸虫 24、36、42天成虫原位杂交结果34-39
• 3.3 RNA干扰39-42
• 3.3.1 筛选RNAi干扰靶点结果39
• 3.3.2 成功构建含PLNHX_Hs U6_Vasa39-40
• 3.3.3 日本血吸虫RNA干扰后Sj Vasa3基因水平变化40-41
• 3.3.4 日本血吸虫RNA干扰后对虫体及产卵影响41
• 3.3.5 日本血吸虫RNA干扰后共聚焦观察形态学的变化。41-42
• 4.讨论42-46
• 4.1 原位杂交结果分析42-44
• 4.2 RNA干扰方法选择44-45
• 4.3 RNA干扰结果讨论45-46
• 5.结论46
• 参考文献46-54
• 个人简历54-55
• 致谢55-56
• 综述56-69
• 参考文献63-69

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