Let-7a对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移、神经分化的影响

发布时间：2017-10-02 17:34

  本文关键词：Let-7a对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移、神经分化的影响

  更多相关文章： 骨髓间充质干细胞 Let-7a Notch-1 HMGA2 增殖 迁移 神经分化

【摘要】：背景与目的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多胚层分化潜能,特定条件下可以分化为多种组织细胞。这为多种疾病的治疗提供了更为广阔的思路。Micro RNAs(mi RNAs)是生物体内一种起调控作用的短小的单链非编码RNA。let-7家族是其中较早发现的一类。其可以通过转录水平、转录后水平调控基因组的表达,参与BMSCs重要的生物学进程。高迁移率族蛋白A2(High-mobility group A,HMGA2)作为高迁移率族蛋白家族(High—mobility group,HMG)成员之一,具有3个与DNA结合的特殊结构,可结合DNA并改变DNA空间构象,调节目的基因的转录活性,参与细胞生物学进程的调控。有研究表明,在肿瘤组织中,let-7可与HMGA2 3’UTR结合,负向调控该基因的表达,抑制肿瘤的发生发展。Notch信号通路广泛的分布于各种生物体内,具有高度的保守性,是影响细胞命运的重要信号通路之一,对细胞的增殖、分化和凋亡都有影响。研究发现micro RNAs能参与Notch信号通路的调控,二者在很多生命进程中存在交互联系。近年来对于Micro RNA家族中Let-7的研究层出不穷,但Let-7a对于BMSCs增殖、迁移、神经分化的作用不甚清晰。本研究通过构建let-7a上调及下调慢病毒载体,将其转染BMSCs来研究不同表达水平的Let-7a对BMSCs体外增殖、迁移、神经分化的影响,及其与HMGA2的表达水平、Notch信号通路的关系。为移植治疗各种神经系统疾病奠定基础。材料与方法1构建大鼠let-7a-up慢病毒载体(LV-rno-let-7a-up和EGFP)、let-7a-inhibition慢病毒载体(LV-rno-let-7a-inhibition和EGFP)、空白慢病毒载体(只含有EGFP)。从大鼠股骨和胫骨分离培养BMSCs。筛选最适转染复数(multiply of infection,MOI)并对其进行转染。实验分组:转染上调组:转染let-7a-up慢病毒;转染下调组:转染let-7a-inhibition慢病毒;阴性转染组:转染空白慢病毒;未转染组:不进行病毒转染。2使用倒置荧光显微镜观察转染后各组细胞的荧光表达情况,评价转染效率。采用q RT-PCR检测各组细胞的let-7a表达水平。3免疫细胞化学法检测各组细胞高迁移率族蛋白2(high mobility group-AT-hook 2,HMGA2)的表达水平;MTT比色法检测各组细胞增殖活力;transwell迁移实验及划痕实验检测各组细胞迁移能力;4法舒地尔诱导各组细胞促使其神经分化,免疫组化法检测诱导后各组细胞神经元烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、神经微管结合蛋白(microtubule associated protein 2,MAP-2)的表达差异;q RT-PCR、Western blot比较诱导后各组细胞Notch-1在基因和蛋白表达水平上的差异。5使用分析软件预测Let-7a与Notch-1基因的结合调控区,并进行靶基因预测;使用双荧光素酶报告基因实验来检测Let-7a对Notch-1的靶向调节作用。6侧脑室移植PKH26标记的BMSCs,第2天及2周后倒置荧光显微镜下观察其在SD大鼠脑内的存活分布情况。结果1阳性克隆PCR证明,let-7a-up慢病毒载体、let-7a-inhibition慢病毒载体、空白慢病毒载体构建成功,孔稀释法测定病毒滴度分别3×108TU/L、3×108TU/L和6×108TU/L。2倒置荧光显微镜下观察let-7a-up慢病毒、let-7a-inhibition慢病毒、空白慢病毒转染BMSCs成功。以转染后第5天EGFP表达最佳。最适MOI为20。与未转染组相比,转染上调组let-7a的表达水平显著升高(P0.05),转染下调组细胞let-7a的表达水平显著降低(P0.05),阴性转染组let-7a的表达水平无明显差异(P0.05);3转染上调组细胞HMGA2表达水平、细胞增殖能力及迁移能力均较未转染组降低(P0.05);转染下调组HMGA2表达水平、细胞增殖能力及迁移能力均较未转染组增强(P0.05);阴性转染组与未转染组无明显差异(P0.05)。4法舒地尔诱导各组细胞神经分化,与未转染组相比,转染上调组神经分化效率增强,NSE、MAP-2表达水平升高,Notch-1及Notch-1 m RNA表达水平下降(P0.05);而转染下调组反之(P0.05);阴性转染组较未转染组无明显差异(P0.05)。5 Target预测显示Notch-1基因3’UTR区存在let-7a结合位点。测序结果表明Notch-1基因3’UTR区野生型/突变型报告基因载体构建成功;检测表明野生型报告基因载体与let-7a共转染细胞的荧光素酶活性较对照组显著减低(P0.05);其他各组较对照组无明显差异(P0.05)。6移植后脑切片显示第2天PKH26阳性的细胞呈团分布在侧脑室,2周后仍有存活并沿侧脑室分布。结论1 let-7a可抑制BMSCs增殖活性及迁移能力。其可能通过下调HMGA2表达水平而发挥抑制作用。2 Let-7a可促进BMSCs神经分化;Notch-1是let-7a的靶基因之一,let-7a可能通过靶向抑制Notch信号通路而促进神经分化。3侧脑室注射显示注入的BMSCs在大鼠脑内2周后依然存活并沿侧脑室分布。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 Let-7a Notch-1 HMGA2 增殖 迁移 神经分化
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 中英文缩略表12-13
• 前言13-16
• 材料与方法16-32
• 实验结果32-36
• 讨论36-40
• 结论40-41
• 参考文献41-45
• 附表与图45-52
• 综述 Let-7a的研究进展52-65
• 参考文献60-65
• 附录 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果65-66
• 致谢66

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本文编号：960955