脐带基质干细胞的分离、鉴定及其向生殖细胞分化的研究

发布时间：2017-10-02 19:11

  本文关键词：脐带基质干细胞的分离、鉴定及其向生殖细胞分化的研究

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【摘要】：研究背景与目的传统理论均认为人卵母细胞是不可再生细胞,免疫、环境、遗传等多种因素及妇科肿瘤的疾病进展、治疗过程均可损害卵母细胞、导致卵巢功能明显降低,甚至衰竭,丧失生育功能,在神经、骨骼、内分泌等多方面影响女性的身心健康~[1-3]。这一类患者即使通过辅助生殖技术也无法获得有功能的卵子。因此,获得再生卵母细胞,是真正有助于解决这类患者无法生育及恢复其生殖-内分泌功能的重要途径~[4]。近年来,国内外研究发现,干细胞具备发育全能性,在一定条件下于体内或体外均可诱导分化为功能细胞~[5-7]。有关胚胎干细胞的研究发现:胚胎原始生殖细胞经体外培养及体内移植可产生有功能的卵母细胞和精子,并成功生育子代~[8]。但胚胎干细胞无法做到自体移植,取材不便、有致瘤性等诸多问题使其研究受到限制~[9]。因此,人们将研究重点转向成体干细胞。其中脐带基质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs),来源于新生儿脐带,不需要任何侵入性的过程就可以在废弃的脐带当中获取它,不存在伦理学争议等优势,均使其成为再生卵母细胞的重要种子来源~[10]。根据目前的研究发现,该细胞具有分化为卵母样细胞的潜能,可表达原始生殖细胞标记物,且能在卵巢局部存活并生长。但均尚未获得功能性配子~[11]。究其原因,与体外使用卵巢卵泡液等诱导方式尚无法完全模拟体内微环境有关。研究显示性腺来源的体细胞更有助于生殖细胞分化~[12],且同步化的卵巢体细胞才能促进原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGCs)进一步减数分裂~[13]。由此我们认为减数分裂前期的胚胎卵巢与干细胞进行共培养,有望更好地模拟体内卵巢卵子发生的微环境,同时充分利用卵巢细胞分泌细胞因子等微环境对干细胞进行环境诱导,可能更有助于观察卵巢微环境在卵子发生中的作用,探索成体干细胞向生殖细胞分化的可能机制。因此我们拟对UCMSCs进行分离培养及鉴定,再与原始生殖细胞共培养,诱导UCMSCs向卵母细胞样细胞进行分化,探索其体外诱导生殖细胞的可能机制,为完全卵母细胞再生的研究提供思路。1实验方法1.1 UCMSCs的分离培养及鉴定采用机械分离方法提取新生儿脐带胶质、进行剪碎后行组织块直接贴壁培养UCMSCs,运用流式细胞学技术检测UCMSCs的免疫表型,进行干细胞鉴定,将P3代UCMSCs作为种子细胞。1.2 PGCs的分离培养及鉴定采用机械分离12.5dpc(days posteoltum,发现阴栓的当天记为0.5dpc)的Balb/c小鼠的胎鼠生殖嵴,剪碎后行组织块直接贴壁培养PGCs,运用AP染色初步鉴定细胞、运用流式细胞学技术检测P3代PGCs的免疫表型,进一步进行细胞鉴定。1.3 PGCs的生物学特性研究取P3代PGCs,细胞免疫荧光染色,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等技术进行PGCs的生物学特性研究。1.4诱导UCMSCs向原始生殖细胞样细胞(Primordial germ cell-like cells,PGCLCs)分化及鉴定取P3代UCMSCs,实验组使用PGCLCs诱导培养液培养,对照组继续使用UCMSCs培养液,采取置于37℃,5%CO_2及饱和湿度下培养,隔日换液,并观察培养液有无浑浊。及倒置显微镜下对照两组细胞形态变化。运用流式细胞学技术检测诱导分化后UCMSCs的免疫表型鉴定。1.5共培养诱导分化UCMSCs取PGCLCs+P0代PGCs为实验组1,P4代UCMSCs+P0代PGCs为实验组2,P4代UCMSCs+P4代UCMSCs为对照组,均利用0.4μm孔径的Transwell小室共培养,置于37℃,5%CO_2及饱和湿度下培养,隔日换液,并观察培养液有无浑浊。1.6 Western blot检测UCMSCs向卵母细胞分化情况取共培养14d后的UCMSCs进行Western blot检测SCP3表达情况,评估其向卵母细胞的分化情况。1.7统计学分析统计学分析应用SPSS18.0统计软件,计量资料以(?)表示,组间比较采用单因素x~2检验,P0.05为差异。2实验结果2.1 UCMSCs的分离培养及鉴定倒置显微镜下观察组织块贴壁培养3-5天后开始有少量长梭形细胞爬出,培养7d后细胞融合达90%,呈漩涡状或者平行排列贴壁生长,杂细胞较少,传代后细胞较均一,形态规则,呈长梭形,增殖快,常于传代后2d再次接近融合状态。流式细胞学技术检测UCMSCs表达中胚层来源分子CD73及分子CD29,阳性率分别为62.9%、95.5%,表达内皮细胞特征分子CD31,阳性率为0.221%,表达造血干细胞系特征分子CD45,阳性率为0.186%,表达阶段特异性胚胎抗原SSEA-1,阳性率为0.946%,符合UCMSCs的特征。2.2 PGCs的分离培养及鉴定倒置显微镜下观察生殖嵴组织块3-5天开始爬出贴壁细胞,5-7天细胞能生长至70%~80%融合,细胞轮廓清楚,排列紧密,大部分细胞形态为核质比较大的圆形或者椭圆形细胞。至80%左右融合状态时进行传代,传代后细胞增殖迅速,常于传代后3天再次接近融合状态。AP染色细胞持续阳性,表明为含有碱性磷酸酶活性阳性的胚胎原始生殖细胞。流式细胞学技术检测PGCs表达阶段特异性胚胎抗原SSEA-1,阳性率为92.5%,表达阶段特异性胚胎抗原SSEA-4,阳性率为0.71%,符合小鼠PGCs的特征。2.3 PGCs的生物学特性研究通过细胞免疫荧光染色及RT-PCR检测可发现,Oct4、Stra8、Vasa、Scp3、Zp3均为阳性表达,表明我们所培养的PGCs是一种来自小鼠胚胎早期的胚胎生殖细胞,处于未分化状态,而且在体外培养过程中可进入减数分裂I期。2.4诱导UCMSCs向PGCLCs分化及鉴定倒置显微镜下观察实验组:经过向PGCLCs诱导7d-9d后,开始出现部分核质比大的圆形或椭圆形细胞,对照组细胞仍然保持长梭形形态。贴壁培养14d后,实验组细胞稳定表达阶段特异性胚胎抗原SSEA-1,阳性率为73.83%,且表达阶段特异性胚胎抗原SSEA-3,阳性率为66.66%,对照组细胞表达阶段特异性胚胎抗原SSEA-1及SSEA-3,阳性率分别为0.69%、0.45%,证明实验组细胞已部分向PGCLCs分化。2.5 Western blot检测UCMSCs向卵母细胞分化情况结果显示,共培养14d后,实验组1的SCP3蛋白表达水平为0.566622±0.008407,实验组2的SCP3蛋白表达水平为0.271562±0.041784,对照组的SCP3蛋白表达水平为0.130108±0.022316,三组间差异有统计学意义(P0.05),其中任意两组分别对比也均有统计学意义(P0.05)。3结论1.分离培养了纯度较高的UCMSCs;2.分离培养了纯度较高的PGCs;3.PGCs于体外可进行持续培养,体外培养过程中可进入减数分裂I期;4.UCMSCs于体外可诱导分化为PGCLCs;5.共培养可体外诱导UCMSCs向卵母细胞方向进行分化。
【关键词】：人脐带基质干细胞 小鼠原始生殖细胞 细胞共培养 分化
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R321
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 脐带基质干细胞的分离与鉴定14-20
• 2.1 实验材料与方法14-16
• 2.2 实验结果16-18
• 2.3 讨论18-19
• 2.4 小结19-20
• 第三章 原始生殖细胞的分离及其生物学特性研究20-31
• 3.1 实验材料与方法20-26
• 3.2 实验结果26-29
• 3.3 讨论29-30
• 3.4 小结30-31
• 第四章 脐带基质干细胞向生殖细胞分化的研究31-43
• 4.1 实验材料与方法31-38
• 4.2 实验结果38-41
• 4.3 讨论41-42
• 4.4 小结42-43
• 全文总结43-44
• 参考文献44-50
• 文献综述 干细胞向生殖细胞分化的研究进展50-58
• 参考文献55-58
• 硕士期间发表文章58-59
• 致谢59

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本文编号：961333