人FHL1各LIM结构域融合蛋白的原核表达、纯化及活性检测

发布时间：2017-10-06 03:05

  本文关键词：人FHL1各LIM结构域融合蛋白的原核表达、纯化及活性检测

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【摘要】：目的构建人FHL1各LIM结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4融合蛋白,并对其活性进行检测。方法用PCR法从FHL1真核表达载体中扩增FHL1的LIM1/2、LIM1、LIM2、LIM3和LIM4基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,通过GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知结合蛋白雌激素受体α(ERα)的相互作用。结果构建得到FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期大小相符的目的蛋白,经Western blot法检测,融合蛋白成功表达;纯化得到GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4五个融合蛋白,GST pull-down证明FHL1全长以及FHL1-LIM1/2、-LIM2蛋白可以和ERα相互作用。结论成功克隆FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4基因,并获得了活性良好的GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4蛋白,为研究FHL1在乳腺癌中的作用奠定了实验基础。
【作者单位】： 解放军总医院内分泌科;军事医学科学院生物工程研究所;解放军总医院第一附属医院肿瘤科;
【关键词】： 人FHL-LIM/、-LIM、-LIM、-LIM和-LIM基因 原核表达 纯化 ERα
【基金】：国家自然科学基金(31100604,30872939,81101065)
【分类号】：R392.12
【正文快照】： FHL(four and a half LIM domain)家族属于LIM超家族,目前发现的FHL家族成员包括FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和FHL5(ACT),它们均由4.5个LIM结构域组成,即含有氨基端半个LIM结构域(LIM1/2)和其后的4个LIM结构域(即LIM1、LIM2、LIM3和LIM4)。LIM(Lin-Isl-Mec)结构域含大约50个氨基

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本文编号：980351