硒蛋白SelK对小胶质细胞和单核细胞胞浆游离钙水平及迁移能力的影响

发布时间：2017-10-10 13:04

  本文关键词：硒蛋白SelK对小胶质细胞和单核细胞胞浆游离钙水平及迁移能力的影响

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【摘要】：小胶质细胞是脑中的”巨噬细胞”,在阿尔茨海默病(AD)发生中具重要作用。硒蛋白SelK是小鼠脑中含量较高的硒蛋白之一,已有研究表明,SelK在活化的巨噬细胞中保持完整而在静息态巨噬细胞和其它细胞中被剪切,完整的SelK能促进内质网中钙离子释放,从而提高吞噬、迁移能力。SelK是否在处于活化态和静息态的小胶质细胞中也保持两种状态,其存在状态和表达量是否影响到细胞中游离钙离子水平、迁移能力,以及是否与阿尔茨海默病(AD)的发生有关,是亟需解决的重要科学问题。为此本论文拟通过对小鼠小胶质细胞进行SelK基因敲减和过表达,阐明SelK与小胶质细胞胞浆中游离钙离子水平间和迁移能力之间的关系。部分研究资料显示血液来源单核细胞清除Aβ蛋白更为有效,为此本论文在研究SelK对小胶质细胞作用的同时,也对单核细胞的作用进行了研究。为达到对小鼠中上述两种细胞中硒蛋白mSelK的有效敲减,我们首先进行了小鼠硒蛋白mSelK表达敲减慢病毒载体的构建工作。将pLKO.1-TRC初始载体中Agel和EcoRI酶切位点之间1.9kb大小的插入片段切除,插入SelK的ShRNA退火片段构建pLKO.1-mSelK-ShRNA载体。将pLKO.1-mSelK-ShRNA载体与包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G共同转染HEK-293T细胞,从而构建mSelK表达敲减慢病毒重组载体pLKO.1-mSelK-ShRNA。用RT-PCR和qPCR方法考察了mSelK表达敲减慢病毒重组载体对上述两种细胞中mSelK的敲减能力。结果显示,在小胶质细胞BV2和单核细胞RAW264.7中mSelK的mRNA含量显著降低,通过2-ΔΔCt粗略计算出其mSelK的表达水平分别仅为原来的0.09倍和0.21倍。从中可以看出,慢病毒基因敲出nSelK的效果非常明显。并且mSelK表达敲减慢病毒重组载体的侵染对细胞活力和非刺激条件下细胞的活化程度没有显著影响。用mSelK表达敲减慢病毒重组载体侵染小鼠小胶质细胞BV2和单核细胞RAW264.7细胞,考察硒蛋白SelK的敲减对静息状态下小胶质细胞和单核细胞胞浆内游离钙水平及细胞迁移能力的影响。其中对细胞胞浆中游离钙的释放的影响通过钙离子探针Fluo-3 AM染色及流式细胞仪测定,对细胞迁移能力的影响通过1transwell小室法测定。结果显示,与未侵染病毒的空白对照组和侵染对照载体的阴性对照相比,nSelK表达敲减慢病毒载体的侵染细胞胞浆中的游离钙水平显著下降,细胞迁移能力显著降低。接下来我们在腺病毒pHBAd-RFP表达载体的基础上,构建了小鼠硒蛋白mSelK过表达腺病毒重组载体pHBAd-RFP-mSelK,以便于接下来所进行的研究。通过western blot证明nSelK过表达腺病毒重组载体在上述两种细胞中能够进行高效表达。并且mSelK过表达腺病毒重组载体的侵染对细胞活力和非刺激条件下细胞的活化程度没有显著影响。通过流式细胞仪检测nSelK过表达对小鼠静息态小胶质细胞和单核细胞中游离钙离子水平的影响,通过Transwell小室法检测mSelK过表达对上述细胞迁移能力的影响,从而证明硒蛋白nSelK在小胶质细胞和单核巨噬细胞中的作用。结果显示,与空白组和腺病毒空载体组相比,当硒蛋白过表达时,细胞胞浆中游离钙水平显著升高,上述细胞的迁移能力显著上升。用小鼠硒蛋白nSelK腺病毒过表达载体侵染小鼠小胶质细胞以便提高mSel K在细胞中的基因数,然后通过vestern blot检测小鼠硒蛋白Ad-mSelK在静息状态和激活状态时的剪切状态及表达量。结果发现,当小胶质细胞细胞由静息态变为激活态时,mSelK逐渐由以剪切状态为主变为以全长状态为主,硒蛋白的表达量大幅增加。表明硒蛋白mSelK主要在细胞的活化过程中发挥作用。由上述实验结果可以得出如下结论：硒蛋白SelK能够通过控制细胞浆内游离钙离子的水平,从而控制小鼠小胶质细胞和单核细胞的迁移能力。当硒蛋白mSelK表达量显著下降时小鼠小胶质细胞和单核细胞胞浆中的游离钙水平显著下降,细胞的迁移能力也随之显著下降；当硒蛋白nSelK表达量显著上升时小鼠小胶质细胞和单核细胞胞浆中的游离钙水平也显著上升,细胞的迁移能力也随之显著提高。并且硒蛋白SelK在静息态的小胶质细胞细胞中处于剪切状态,而在活化的细胞中,当发挥吞噬和迁移能力大量需要钙离子时,保持完整,并且表达量显著提高,这对于阿尔兹海默症的防治是极为有力的。
【关键词】：硒蛋白 SelK 钙离子 迁移 阿尔茨海默病
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-16
• 引言16-22
• 0.1 硒蛋白16-17
• 0.2 阿尔茨海默病及其发病机理、研究意义17
• 0.3 小胶质细胞、骨髓/血液来源单核细胞与阿尔茨海默病之间关系17-20
• 0.4 硒蛋白与阿尔茨海默病之间关系的研究进展20
• 0.5 研究目的和意义20-22
• 第1章 小鼠硒蛋白mSelK表达敲减慢病毒载体的构建22-32
• 1.1 实验方案22
• 1.2 实验材料和方法22-30
• 1.2.1 分子生物学常用酶22
• 1.2.2 菌种、细胞与质粒22-23
• 1.2.3 实验仪器23
• 1.2.4 常用试剂23-24
• 1.2.5 pLKO.1-mSelK-ShRNA载体的构建24-28
• 1.2.6 慢病毒包装28-30
• 1.3 实验结果与分析30-31
• 1.3.1 重组慢病毒载体的酶切验证30-31
• 1.3.2 重组慢病毒载体的293T细胞包装结果31
• 1.4 小结31-32
• 第2章 慢病毒载体pLKO.1-mSelK-ShRNA对小胶质细胞和单核细胞的游离钙水平及迁移能力的影响32-51
• 2.1 实验材料32-34
• 2.1.1 细胞32
• 2.1.2 培养基和试剂32-33
• 2.1.3 实验仪器33-34
• 2.1.4 常用生化试剂34
• 2.2 实验方法34-43
• 2.2.1 细胞的培养34-35
• 2.2.2 慢病毒载体mSelK-ShRNA侵染侵染小胶质细胞和单核细胞35
• 2.2.3 RT-PCR法考察细胞内mSelK基因敲减后mRNA表达的变化35-38
• 2.2.4 实时定量PCR法考察细胞内mSelK基因沉默后mRNA表达的变化38-40
• 2.2.5 MTT法检测慢病毒侵染后的细胞活力40-41
• 2.2.6 慢病毒侵染后细胞活化程度的NO测定41-42
• 2.2.7 慢病毒载体侵染对小胶质细胞和单核细胞胞浆中游离钙离子浓度的影响42
• 2.2.8 慢病毒载体侵染对小胶质细胞和单核细胞迁移能力的影响42-43
• 2.3 实验结果43-50
• 2.3.1 mSelK-ShRNA慢病毒重组载体侵染BV2及RAW264.7的最佳MOI43-44
• 2.3.2 RNA完整性鉴定44
• 2.3.3 RT-PCR法考察细胞内mSelK基因沉默后mRNA表达的变化44-45
• 2.3.4 实时定量PCR法考察细胞内mSelK基因沉默后mRNA表达的变化45-46
• 2.3.5 mSelK-ShRNA慢病毒重组载体侵染对小胶质细胞活力的影响46-47
• 2.3.6 mSelK-ShRNA慢病毒重组载体侵染对非刺激条件下小胶质细胞活化的影响47-48
• 2.3.7 mSelK-ShRNA慢病毒重组载体侵染对小胶质细胞和单核细胞胞浆游离Ca~(2+)浓度的影响48-49
• 2.3.8 mSelK-ShRNA慢病毒载体侵染BV2细胞迁移能力的影响49
• 2.3.9 mSelK-ShRNA慢病毒载体侵染RAW264.7细胞迁移能力的影响49-50
• 2.4 分析与讨论50
• 2.5 小结50-51
• 第3章 mSelK过表达腺病毒重组载体对小胶质细胞中游离钙水平及迁移能力的影响51-75
• 3.1 实验材料51-53
• 3.1.1 细胞51
• 3.1.2 培养基和试剂51-52
• 3.1.3 实验仪器52-53
• 3.2 实验方法53-65
• 3.2.1 细胞的培养53
• 3.2.2 mSelK过表达腺病毒重组载体pHBAd-mSelK的扩增53-54
• 3.2.3 腺病毒TCID50病毒滴度测定54-55
• 3.2.4 用mSelK过表达腺病毒重组载体侵染小胶质细胞55
• 3.2.5 MTT法检测腺病毒侵染后的细胞活力55-56
• 3.2.6 Gress法检测非刺激条件下腺病毒侵染对细胞活化状态的影响56
• 3.2.7 mSelK过表达腺病毒重组载体侵染对小胶质细胞胞浆中游离钙离子浓度的影响56
• 3.2.8 mSelK过表达腺病毒重组载体侵染对小胶质细胞细胞迁移能力的影响56-57
• 3.2.9 Western Blot法考察细胞内mSelK过表达腺病毒重组载体侵染对小胶质细胞mSelK蛋白表达量的影响57-64
• 3.2.10 Western Blot考察脂多糖LPS刺激对小鼠硒蛋白mSelK的剪切状态及表达量的影响64-65
• 3.3 实验结果65-73
• 3.3.1 pHBAd-MCMV-RFP-SelK重组载体测序结果65-66
• 3.3.2 mSelK过表达腺病毒重组载体pHBAd-mSelK的扩增66-67
• 3.3.3 扩增后腺病毒TCID50病毒滴度测定67-68
• 3.3.4 腺病毒Ad-mSelK过表达载体侵染小胶质细胞的MOI68-69
• 3.3.5 MTT法检测腺病毒侵染后的细胞活力69-70
• 3.3.6 腺病毒侵染对非刺激条件下细胞活化状态的影响70
• 3.3.7 腺病毒重组载体侵染对BV2细胞胞浆中游离钙离子浓度的影响70-71
• 3.3.8 腺病毒重组载体侵染对细胞迁移能力的影响71-72
• 3.3.9 BCA蛋白定量分析结果72-73
• 3.3.10 腺病毒重组载体Ad-mSelK侵染小胶质细胞后,细胞中硒蛋白mSelK表达量升高的验证73
• 3.4 分析与讨论73-74
• 3.5 小结74-75
• 结论与展望75-76
• 致谢76-77
• 参考文献77-81
• 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 肖亚;赵斌;;小胶质细胞在阿尔茨海默病发病中的作用研究进展[J];神经疾病与精神卫生;2010年01期

2 宋阳;薛一雪;朱丽娜;刘云会;;移植小胶质细胞对阿尔茨海默病大鼠脑内β-淀粉样蛋白的吞噬作用[J];中国老年学杂志;2008年03期

3 林珏龙;陈耀文;谢仰民;李玫;朴仲贤;杨海伟;;小鼠巨噬细胞内游离钙离子变化介导的吞噬作用(英文)[J];激光生物学报;2006年01期

4 李谷才,尹端l，

本文编号：1006510