大鼠不同脑区AD-相关蛋白的表达特征及其在内质网应激时的改变

发布时间：2017-10-18 14:27

  本文关键词：大鼠不同脑区AD-相关蛋白的表达特征及其在内质网应激时的改变

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【摘要】：背景：阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种常见的神经退行性疾病,以进行性认知功能障碍为主要临床特征,神经元内形成的以过度磷酸化tau蛋白为主要成分的神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFTs)、神经元外由β-淀粉样蛋白(β-amyloid pepitide, Aβ)聚积成老年斑(Senile plaques, SP)为其主要病理特征,同时伴有突触丢失。AD发病过程中,NFTs与SP累及的脑区具有选择性、并随病程的延长而扩展。如,在AD病变早期(Braak分期的I、II期)NFTs最早出现在内嗅皮层,在Ⅲ、Ⅳ期则广泛分布于内嗅皮层并累及海马CA1区,至V、VI期在新皮层的广泛区域可见NFTs。SP的沉积首先出现在新皮质,然后是颞叶,最后出现在海马等区域。AD患者脑内突触丢失的严重程度与同一脑区NFTs的数量高度正相关,突触蛋白(突触前后膜蛋白、突触囊泡蛋白)的减少与临床痴呆程度密切相关。在AD发病过程中,海马是NFTs、SP、突触丢失累及最为严重的脑区,而小脑受累程度最轻、时间最晚。为什么在AD发病过程中小脑受累程度最轻、时间最晚?这一问题引起了我们的关注。糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)和蛋白磷酸酯酶2A (Protein phosphoesterase, PP2A)是调节tau蛋白磷酸化水平的重要激酶和酯酶；Ap是由淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)在p、γ分泌酶的作用下的分解产物。内质网(Endoplasmic reticulum, ER)应激与AD发病密切相关,ER应激能影响tau蛋白磷酸化及Ap产生。因此,本研究进一步研究了在ER应激条件下,不同脑区tau蛋白及其磷酸化水平、Ap水平、突触相关蛋白及相关分子的变化。 目的：比较正常SD大鼠不同脑区(颞叶皮层、额叶皮层、海马、小脑)tau蛋白总水平及特定位点的磷酸化水平、APP及Aβ水平、突触相关蛋白水平；并观察ER应激后上述分子在不同脑区的表达变化及可能机制。 方法：免疫印迹、免疫组化技术结合特异性抗体显示SD大鼠(雄,4月龄)不同脑区特定蛋白的水平及分布,包括tau蛋白及特定位点磷酸化的tau蛋白,APP及磷酸化的APP (p-APP),突触相关蛋白[α氨基羟甲基恶唑丙酸(Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, AMPA)受体.-GluR1, GluR2, N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic Receptor, NR)-NR1, NR2A,NR2B,突触后密度蛋白95(Postsynaptic density protein95, PSD95),突触蛋白1(Synapsin1)],以及GSK-3β、PP2A、丝裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen-actived proein kinases, MAPKs)等。并通过神经胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)免疫组化染色显示星型胶质细胞、离子钙接头蛋白(Ionized calcium binding adaptor molecule1, Ibal)染色显示小胶质细胞。酶联免疫吸附法检测不同脑区Aβ40、Aβ42水平及其比率。ER应激诱导剂依霉素(Tunicamycin, TM,10μ1,50μM)通过左侧侧脑室(前囟后0.8mm、旁开1.5mm、深3.8-4.0mm)注射入SD大鼠侧脑室中,48h取材。 结果：正常SD大鼠颞叶皮层、额叶皮层、海马、小脑的tau总水平无差异,而且TM注射48小时后,上述脑区的tau蛋白总水平无显著变化。tau蛋白Ser198/199/202、Thr205、Ser214、Ser262位点的磷酸化水平在正常SD大鼠颞叶皮层、额叶皮层、海马、小脑之间无差异。TM注射48小时后,tau蛋白Ser198/199/202磷酸化水平在颞叶皮层、额叶皮层和海马明显上升,在小脑无变化；hr205、Ser214位点磷酸化水平在颞叶皮层、额叶皮层明显上升,在海马、小脑无变化；Ser262位点的磷酸化水平仅在海马明显上升。 正常SD大鼠颞叶皮层、额叶皮层的tau蛋白Ser404和Ser422位点磷酸化水平明显高于海马、小脑；而且TM注射48小时后Ser404和Ser422位点磷酸化水平在颞叶皮层和额叶皮层明显上升,而在小脑和海马无变化。 正常SD大鼠小脑tau蛋白在Ser396、Thr231和Ser202/Thr205位点磷酸化水平明显低于颞叶皮层、额叶皮层和海马,而且TM注射48小时后,小脑Ser396、Thr231位点磷酸化水平无变化。TM注射48小时后,tau蛋白Ser396位点的磷酸化水平在颞叶皮层和额叶皮层显著上升；Thr231位点的磷酸化水平在额叶皮层和海马显著上升；Ser202/Thr205位点的磷酸化水平在上述四个脑区均明显上升。同时免疫组化也进一步验证了tau蛋白在Ser396、Thr231、Ser404位点的磷酸化水平在TM注射前后在四个脑区的变化。 正常SD大鼠颞叶皮层、额叶皮层、海马、小脑的总APP水平无差异,p-APP在小脑和海马水平明显低于颞叶皮层和额叶皮层,且在额叶皮层的水平低于颞叶皮层,另其分子量为～72KDa处在小脑的表达水平明显低于另三个脑区；正常SD大鼠颞叶皮层、额叶皮层、海马、小脑的Aβ40水平和Aβ40/Aβ42无差异,但小脑Aβ42的水平明显低于颞叶皮层、额叶皮层；Aβ的十七聚体4G8在小脑和海马的水平明显低于颞叶皮层、额叶皮层。TM注射48小时后,颞叶皮层、额叶皮层、海马、小脑的Aβ40、Aβ42水平和Aβ40/Aβ42均无变化。 正常SD大鼠小脑的GluR2、NR1、NR2A、NR2B和PSD95明显低于颞叶皮层、额叶皮层、海马,小脑的突触蛋白1(Synapsin1)水平明显低于颞叶皮层,且小脑、海马的GluRl水平明显高于颞叶皮层、额叶皮层。 正常SD大鼠颞叶皮层、额叶皮层、海马、小脑的磷酸化蛋白激酶样的内质网激酶(Protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、磷酸化肌醇需酶1(Inositol requiring1, IRE1)水平无差异,小脑的激活转录因子6(Activating transcription factor6,ATF6)磷酸化水平低于另三个脑区,小脑的免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin-binding protein, Bip)水平高于另三个脑区。TM注射48小时后大鼠颞叶皮层、额叶皮层和海马的Bip、磷酸化PERK (p-PERK)、磷酸化IRE1(p-IREl)水平增高,额叶皮层和海马的磷酸化ATF6(p-ATF6)水平增高,上述ER应激标志分子在小脑无改变。同时免疫组化也进一步验证了Bip和p-IRE1在TM注射前后在颞叶皮层、额叶皮层和海马的变化。 正常SD大鼠小脑的GSK-3β水平低于另三个脑区,而在Ser9和Tyr216位点磷酸化的GSK-3β水平与另三个脑区无差异；小脑和海马的Tyr307位点磷酸化的PP2Ac水平、去甲基化的PP2Ac (DM-PP2Ac)水平低于颞叶皮层和额叶皮层；细胞外信号调节蛋白激酶(extracelluar-signal regulated protein kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38、p-P38在颞叶皮层、额叶皮层、海马、小脑的水平无差异,小脑区的磷酸化ERK (p-ERK)水平低于另三个脑区。TM注射48小时后,除小脑外,颞叶皮层、额叶皮层、海马的GSK-3β被激活,四个脑区的总PP2A、Y307-PP2Ac、DM-PP2Ac均无明显变化；颞叶皮层、额叶皮层、海马的p-ERK水平明显下降,而小脑无变化；p-JNK在颞叶皮层、额叶皮层的水平明显上升,在小脑和海马的水平无变化；p-P38在四个脑区的水平均无变化。 TM注射48小时后,星型胶质细胞在颞叶皮层、额叶皮层、海马以及海马的CA1、CA3、CA4和DG区的染色变深,细胞胞体明显增大,除DG区外其它脑区的细胞数均明显增多；小胶质细胞仅在DG区的细胞数明显增多,细胞胞体在所有观察脑区明显增加。 结论：与另三个脑区相比,无论是生理状态还是TM诱导的内质网应激条件下,小脑的磷酸化tau蛋白和p-APP水平均处于较低水平；同时,小脑对内质网应激诱导剂不敏感。我们的研究结果部分解释了为什么小脑区不易形成神经原纤维缠结和老年斑。此外,小脑区的GluR2, NR1,NR2A, NR2B和PSD95亦呈低水平表达,可能与小脑在学习记忆中发挥的作用比较有限有关。ER应激后,颞叶、额叶皮层磷酸化tau蛋白在Ser396、Thr231位点显著上升、突触相关蛋白无显著变化；颞叶皮层、颚叶皮层和海马星型胶质细胞和小胶质细胞激活；而海马tau蛋白磷酸化水平在多位点显著上升、突触相关蛋白显著减少,其机制涉及ER应激相关标记分子水平上升、GSK-3β与JNK的激活等。 背景：在发病早期AD患者神经元内出现tau蛋白过度磷酸化、Ap产生过多的同时,神经元突触数量已显著减少。神经元突触是神经元之间建立信息交流的主要结构,结合电镜、免疫细胞化学、生物化学等技术,研究者通过脑组织活检发现AD发病后的2-4年里,患者颞叶、额叶突触数量减少25-35%,平均每个神经元丢失15-35%的突触；海马突触数量减少最为显著,大约有44-55%的突触丢失；枕叶皮质突触数量减少最轻；随着病程进展,突触丢失不断增加。进一步的研究发现突触丢失的严重程度与同一脑区神经元纤维缠结的数量高度正相关；有关突触丢失与老年斑数量之间关系的研究结果并不一致。除突触数量减少外,AD患者脑内突触蛋白(突触前后膜蛋白、突触囊泡蛋白)的减少与临床痴呆程度密切相关。在第一部分实验中我们观察到ER应激后海马突触相关蛋白显著减少；本课题组付政祺等人曾观察到侧脑室注射TM(10μl,50μM,45h)可诱导大鼠空间记忆障碍,那么ER应激诱导剂TM侧脑室注射后还可以引起大鼠哪些行为学改变?TM诱导大鼠发生空间记忆障碍可能的分子基础是什么?本实验将回答这两个问题。 目的：研究SD大鼠侧脑室注射TM后,通过电跳台、旷场、强迫游泳、高架十字迷宫等实验检测大鼠有否记忆障碍、自发活动、焦虑及抑郁等行为学改变；同时检测与学习记忆相关的CREB信号分子以探讨其可能的分子机制。 方法：本实验对SD大鼠进行侧脑室立体定位注射TM诱导ER应激(模型复制同第一部分),并于TM注射后24h和48h应用电跳台、旷场、强迫游泳、高架十字迷宫等实验进行行为学检测；然后,采用Nissl染色检测大鼠颞叶皮层、额叶皮层、小脑和海马的神经元数量,通过Golgi染色和免疫印迹等检测海马树突棘数量及分类、谷氨酸受体和突触相关蛋白的水平、CREB等相关信号分子的变化,通过免疫组织化学染色和免疫荧光染色检测CREB在不同区域的分布及与GSK-3β的关系等。 结果：电跳台实验发现TM注射24h和48h后SD大鼠出现记忆障碍；旷场实验发现,TM诱导24h和48h后均出现了自发活动增加的现象；高架十字迷宫检测发现TM诱导24h和48h后大鼠在开放臂所处时间和次数明显高于对照组。TM注射组与对照组大鼠在强迫游泳实验中无显著性差异。上述行为学结果与课题组前期结果提示：TM侧脑室注射后,大鼠出现记忆障碍、探究行为增加。为进一步研究TM诱导大鼠空间记忆障碍的机制,我们通过Nissl染色发现TM注射后大鼠海马CA1区神经元数量减少14%,而DG区、CA3和CA4以及颞叶皮层、额叶皮层、小脑神经元数量无改变。Golgi染色显示TM注射后仅见海马的DG区树突棘数量减少,而CA1、CA3区树突棘数量无变化；蘑菇型树突棘数量在CA1、CA3和DG区明显下降,而细长型树突棘数量在CA1区明显减少、但在CA3区和DG区则明显增多。 通过免疫印迹检测发现海马的GluR2、Synpsinl、PSD95在TM注射后明显下降；我们在第一部分实验中发现除GSK-3β激活外,进一步发现磷酸化的ERK水平下降；本实验中发现PP1水平和细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)水平上升(p25/35),CREB在Ser129位点的磷酸化水平升高而Ser133位点的磷酸化水平下降。 免疫组织化学染色发现Ser133位点磷酸化的CREB(pSer133-CREB)主要分布在海马DG区,在CA1、CA3和CA4区呈散在分布,且着色很淡；TM诱导后主要表现为DG区的表达明显降低。Serl29位点磷酸化的CREB(pSer129-CREB)在海马的CA1、CA3和DG区分布较多且着色较深,TM诱导后于海马的CA1、CA3、CA4和DG区均明显增多,着色增深。免疫荧光染色发现TM诱导后可致皮层和海马的pSer133-CREB在核内分布减少而pSerl29-CREB在核内分布增多,两者在胞浆与GSK-3β存在共定位。 结论：TM可以诱导记忆障碍,除了与海马CA1区神经元数量下降外有关外,DG区树突棘数量减少、海马蘑菇型树突棘数量减少以及突触相关蛋白GluR2、Synpsinl、PSD95的下降可能在其中起着重要作用；其分子机制可能涉及Cdk5、ERK/CREB或GSK-3β/CREB等。
【关键词】：阿尔茨海默病 内质网应激 不同脑区 过度磷酸化 tau蛋白 β-淀粉样蛋白 谷氨酸受体 星形胶质细胞 小胶质细胞 阿尔茨海默病 记忆障碍 突触蛋白 树突棘 环—磷酸腺苷反应原件结合蛋白(CREB) ERK GSK-3β
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要6-12
• Abstract12-19
• 第一部分 正常和内质网应激大鼠不同脑区tau、Aβ、谷氨酸受体及相关调节因子的表达特征及意义19-69
• 前言19-23
• 材料和方法23-35
• 结果35-57
• 讨论57-61
• 小结61-62
• 参考文献62-69
• 第二部分 内质网应激损伤大鼠记忆及相关分子机制69-106
• 前言69-72
• 材料和方法72-79
• 结果79-97
• 讨论97-100
• 小结100-101
• 参考文献101-106
• 总结106-107
• 本论文的主要创新点107
• 下一步研究计划107-108
• 综述1 小脑与阿尔茨海默病108-125
• 参考文献117-125
• 综述2 Melatonin in Alzheimer's Disease(abstract)125-127
• 附录一 文中主要英文缩写127-129
• 附录二 博士期间获得的主要奖励129
• 附录三 博士期间论文发表情况129-130
• 附录四 博士期间参与的国家自然科学基金130
• 附录五 博士期间参与的学术活动130-131
• 致谢131-132

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