雌激素降低慢性低灌注后血管-神经元损伤及其机制

发布时间：2017-10-21 16:20

  本文关键词：雌激素降低慢性低灌注后血管-神经元损伤及其机制

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【摘要】：目的通过制作雌性去势大鼠双侧颈总动脉永久结扎（Bilateral Common CarotidArtery Occlusion，BCCAO）模型，观察大鼠脑慢性低灌注不同时期各组神经血管单元（Neurovascular Unit，NVU）的损伤情况，探索长期生理剂量雌激素（17-β-estrodiol，E2）替代治疗介导的多靶点的神经血管单元的保护作用并探讨其可能的分子机制，为临床上由于慢性低灌注引起的血管性痴呆等提供新的治疗策略。 方法1制作雌性去势大鼠BCCAO实验动物模型：采用SPF级成年雌性SD大鼠，体重280~300g，行双侧卵巢切除术（OVX）一周后制作分阶段双侧颈总动脉永久结扎模型，，实验动物随机分为慢性低灌注早期组：sham，BCCAO（6h、1d、3d、7d），BCCAO3d+安慰剂，BCCAO3d+E2和慢性进展期组：sham3m，BCCAO3m，BCCAO+安慰剂，BCCAO3m+E2。2采用伊文氏兰（Evans Blue，EB）和荧光素钠（NaF）染色技术观察大鼠BCCAO后染料向组织的渗漏，采用Western blot技术检测大鼠皮质区及海马区紧密连结蛋白ZO-1、Occludin的表达水平变化以评估血脑屏障损伤状况及程度。3采用免疫组织化学技术检测各组大鼠大脑皮质及海马区血管IgG的渗漏程度，以观察BCCAO后不同时期各组大脑微血管的损伤情况。4采用免疫组织化学技术检测各组大鼠大脑皮质及海马区血管形态及血管密度的变化，以探求BCCAO后不同时期血管的病理发展变化。5采用透射电镜技术观察不同时期各组海马神经血管单元损伤的超微结构。6Western blot技术检测血管内皮细胞生长因子VEGF、神经元骨架蛋白MAP2的表达及雌激素的作用。7激光共聚焦扫描显微镜技术观察BCCAO后不同时期神经元及星形胶质细胞的变化及VEGF的免疫定位以及E2的作用。 结果1慢性低灌注早期血脑屏障通透性显著增加。EB和NaF渗漏于BCCAO后1d开始显著增加（P0.05），并于3d达到高峰，7d显著下降，但仍高于sham组。2大脑慢性低灌注早期通过影响紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达破坏血脑屏障的完整性。Western blot结果显示BCCAO3d时间点，与相对应时间点sham组相比，海马及皮质ZO-1、Occludin表达水平显著下降（P0.05）。3IgG免疫组织化学染色结果显示：与相应sham（3d或3m）组相比，BCCAO后3d、3m组皮层和海马CA1区可见大量损伤的血管被IgG免疫染色包围；与BCCAO3d组相比，海马CA1区BCCAO3m组IgG在血管周围的染色较弱。给予E2处理均可显著降低血管IgG的渗漏；4BCCAO后微血管密度的变化以及雌激素的保护作用。采用RECA-1免疫组织化学染色法结果显示：皮质及海马CA1区sham（3d和3m）组50~500大小的血管较少，而BCCAO组（3d、3m）小血管的数量显著增加，雌激素处理组显著降低BCCAO处理后小血管的数量。像素大于2001的血管数目于BCCAO （3d、3m）后显著降低（P0.05），生理剂量雌激素替代治疗可有效增加大血管密度（P0.05）。5BCCAO后神经血管单元损伤的超微结构以及长期生理剂量雌激素替代的保护作用。实验动物各组大鼠海马超薄切片经透射电镜扫描后发现：BCCAO3d和3m组海马CA1区血管周围严重水肿，血管轻度扩张及内皮细胞超微结构的损伤；神经元细胞核轻度固缩，核内染色质凝集，边集，线粒体肿胀，嵴断裂，部分可见凋亡现象。贴附于血管周围的星形胶质细胞形态肥大，胞突终端明显水肿，线粒体嵴断裂。给予E2可显著改善血管神经元单元的超微结构。6雌激素可能通过调节VEGF、MAP2的表达发挥其神经血管单元的保护作用。Western blot结果显示海马CA1区VEGF的表达于BCCAO后6h,1d显著增高，此后显著降低，于3d达最低，且BCCAO后3m VEGF水平较sham3m组显著降低；与相应sham组相比，MAP2表达于BCCAO后3d、7d及3m组显著降低（P0.05）；E2可显著升高BCCAO后海马CA1区VEGF及MAP2的表达（P0.05）。7激光共聚焦扫描显微镜结果示VEGF在BCCAO后6h、1d高表达于神经元，而在BCCAO后3d、7d甚至3m主要表达于星形胶质细胞，且其表达变化与western blot结果一致。 结论1大鼠脑慢性低灌注可以通过破坏血管紧密连接蛋白而诱发神经血管单元结构及功能的损伤；2长期生理剂量17-β-雌二醇替代治疗能够有效发挥其对神经血管单元多靶点的整体保护作用；3雌激素通过上调血管内皮细胞生长因子VEGF及MAP2表达发挥神经血管单元的保护作用。
【关键词】：双侧颈总动脉结扎 慢性脑低灌注 血脑屏障 17-β-雌二醇 血管密度 血管内皮生长因子 微管相关蛋白2
【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.13
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 英文缩略表 续表11-12
• 引言12-14
• 第1章 实验研究14-42
• 1.1 材料与方法14-24
• 1.1.1 实验材料14-19
• 1.1.2 试验方法19-24
• 1.1.3 统计学处理24
• 1.2 结果24-33
• 1.2.1 BCCAO 早期血脑屏障的完整性破坏24-26
• 1.2.2 BCCAO 后微血管渗漏及 E2 替代治疗的保护作用26
• 1.2.3 BCCAO 对大脑微血管密度的影响及 E2 替代治疗的保护作用26-29
• 1.2.4 BCCAO 诱导 NVU 超微结构的损伤及 E2 对 NVU 的保护作用29-30
• 1.2.5 BCCAO 显著降低 VEGF 和 MAP2 的蛋白表达，E2 可逆转此变化30-32
• 1.2.6 E2 可通过调节 VEGF 的定位及表达发挥其 NVU 整体的保护作用32-33
• 1.3 讨论33-37
• 1.4 结论37
• 参考文献37-42
• 第2章 综述神经血管单元的研究进展42-51
• 2.1 神经血管单元概述42-45
• 2.1.1 星形胶质细胞43
• 2.1.2 血脑屏障的紧密连接43-44
• 2.1.3 周细胞44
• 2.1.4 细胞外基质44-45
• 2.2 神经血管单元各组分间的信号传递45-46
• 2.2.1 转化生长因子（TGF-β）信号通路与神经血管单元45
• 2.2.2 Notch 信号通路在神经血管单元中的作用45-46
• 2.2.3 Wingless 信号通路与神经血管单元46
• 2.3 展望46
• 参考文献46-51
• 致谢51-52
• 导师简介52-53
• 作者简介53-54
• 学位论文数据集54

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