甲基牛扁亭对阿尔茨海默氏病细胞模型的作用及其相关分子机制的研究

发布时间：2017-10-23 22:23

  本文关键词：甲基牛扁亭对阿尔茨海默氏病细胞模型的作用及其相关分子机制的研究

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【摘要】：研究背景和研究目的阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease, AD)是一种慢性进行性神经系统变性病,是痴呆最常见的病因。临床上最常见的早期症状是很难记住最近发生的事件,即短期记忆丧失。主要症状为逐渐加重的认知功能障碍、记忆损伤、失语、失用、计算力损害及行为异常等。随着全球进入人口老龄化时期,AD患者的数量也呈上升趋势。AD显著影响老年人的日常生活,加重家庭和社会的经济负担,已经成为社会关注的焦点。迄今为止,AD的病因及发病机制仍然不清楚,所以也无特效的治疗方法。进一步明确AD的发病机制,寻求治疗疾病的更有效药物和方法,是目前亟待解决的重大问题。AD患者的大体病理改变呈弥漫性脑萎缩,尤其以颞、顶、前额叶及海马萎缩明显,而且这种病理改变随着病情进展逐渐加重。镜下最典型的病理特征为细胞外的老年斑(senile plaques, SPs)、细胞内的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)及神经元的丢失。老年斑是含有β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)、早老素1、早老素2、载脂蛋白E、α 1抗糜蛋白酶、α2巨球蛋白和泛素等的细胞外沉积物,神经元纤维缠结主要由高度磷酸化的tau蛋白(一种微管相关蛋白)在细胞内异常聚集形成。研究发现AD发病与大脑内Aβ异常聚集有关,Aβ寡聚体对突触和神经元具有损伤作用,是疾病发生发展中的关键所在。因此,研究Aβ对神经细胞的毒性作用及损伤机制,有助于明确AD的发病机制,进而为寻求新的治疗方法提供可靠依据及方向。自噬(autophagy)是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统。是细胞对持续性内外刺激的非损伤性应答反应,主要起维持细胞结构、代谢和功能的平衡的作用。根据底物进入溶酶体的途径不同,自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的吞噬三种形式。其中我们最常见的是巨自噬。在某些因素的诱导下,胞质内被降解物的周围出现特异性的杯状的双层膜结构,随着膜延伸、闭合,最终形成双层膜球形小泡,即自噬体。接着,自噬体外层膜与溶酶体膜(或者内吞体膜)融合,成为自噬溶酶体。只有内膜的自噬体在溶酶体内被水解酶降解,其降解产物可被细胞再循环利用。在自噬发生过程中,LC3的修饰在膜的延伸和扩张过程中起着重要的作用。LC3B前体形成后,其C末端的5个氨基酸残基被剪切,暴露甘氨酸残基,转化成胞浆可溶性形式LC3B-Ⅰ；LC3B-Ⅰ在酶的催化作用下与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺PE结合,被修饰成膜结合的LC3B-Ⅱ工脂化形式,定位于自噬前体和自噬体的双层膜上。在哺乳动物细胞中检测自噬体时,LC3经常被用作特异性标记蛋白。哺乳动物雷帕霉素靶点(Mammalian target of rapamycin, mTOR)是自噬的一个主调控器。有研究表明,在哺乳动物细胞中,mTORCl激酶可能通过调节ULK1复合物的活性来抑制自噬的发生。可参与各种生理和病理过程,其中包括衰老和神经退行性疾病。有学者发现,AD病人及APP转基因小鼠大脑内肿胀变性的轴突中含有大量的异常聚集的自噬泡,并在这些自噬泡中检测到Aβ、β CTF及Y-分泌酶复合物等,据此提出Aβ相关的自噬泡的异常累积是导致神经元功能紊乱及缺失的原因,并最终导致神经退行性病变。但自噬参与AD发生发展的具体机制尚不明确,仍需要继续研究。MLA,是从翠雀野百合中分离的一种生物碱。研究发现MLA可以结合到烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)的α银环蛇毒素位点上,是一种非常强效的特异性的nAChR配体,其拮抗作用具有特异性、可逆性、浓度依赖性等特点。在AD患者大脑的新皮质和海马部位,乙酰胆碱能受体(AChR)也减少,尤其是a7型烟碱型乙酰胆碱受体(a7-nAChR)。有研究发现Aβ是先在细胞内产生,随后被转运到细胞外,聚集沉积后形成老年斑,而细胞外聚集的异常蛋白Aβ可与细胞膜上α7nAchRs结合,通过细胞的内吞作用进入胞内,最终经由自噬-溶酶体系统降解。a 7nAChR在AD患者脑内的老年斑内聚集,并在Aβ聚集的神经元内与之共存,但具体机制不清。依据上述背景,本研究以MLA为工具,通过干预AD细胞模型,观察其自噬改变并研究自噬在其中发挥的作用及参与调控的相关因子。这有助于明确AD的发病机制,进而为寻求新的治疗方法提供可靠依据及方向。研究内容1. 研究外源性的Aβ25-35对SH-SY5Y细胞的毒性作用。2. 研究外源性的Aβ25-35是否能够诱导SH-SY5Y细胞自噬及可能的作用机制。3. 研究外源性的Aβ2-35诱导SH-SY5Y细胞的毒性及自噬的相关性。4. 研究MLA是否可以保护SH-SY5Y细胞拮抗Aβ的毒性作用。5. 研究MLA是否可以拮抗Aβ诱导的SH-SY5Y细胞自噬及相关作用机制。研究方法1.AD细胞模型的构建、培养：人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)正常培养,老化处理的Aβ25-35进行外源性干预,从而构建AD细胞模型。2.细胞存活率的检测：MTT法检测细胞存活率。3.细胞凋亡的检测：3.1流式检测,观察细胞凋亡情况。3.2 Hoechest33258染色结合荧光显微镜,观察细胞核凝集。4.细胞自噬的检测：4.1电镜观察细胞内自噬泡的数量及分布。4.2通过检测LC3-Ⅱ蛋白水平明确自噬是否被诱导。4.3通MDC染色在荧光显微镜下观察细胞中酸性膜泡的数量及分布。5.siRNA干扰：通过beclin 1 siRNA对细胞进行干扰,降低beclin 1在细胞中的表达水平。6.细胞蛋白表达水平检测：使用western blot法检测LC3-Ⅱ, p70s6k, p-p70s6k、p62的蛋白水平。研究结果1. Aβ诱导SH-SY5Y细胞毒性及其作用机制1.1 Aβ25-35可引起SH-SY5Y细胞存活率下降,并且成一定的剂量和时间依赖性。1.2 A β25-35可诱导SH-SY5Y细胞自噬增强。电镜下观察Aβ处理的SH-SY5Y细胞,与对照组相比,细胞内的自噬泡数量增加。5μM、10μM、20μMAβ处理细胞4小时后可以引起细胞内LC3-Ⅱ的表达水平增加。1.3 Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞自噬形成增强,不影响自噬泡和溶酶体的结合。10μMA β处理细胞4小时后,与对照组相比,可以引起细胞内MDC标记的酸性膜泡数量增加,同时细胞内p62降解明显增加。氯喹可抑制自噬泡和溶酶体的结合过程,引起P62和LC3-Ⅱ表达增加,当Aβ25-35和氯喹合用时,P62和LC3-Ⅱ表达增加进一步增加,说明Aβ25-35诱导自噬泡的形成增加,而不是阻断自噬泡的降解。1.4 Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞存活率下降与其诱导的自噬增强密切相关。Aβ处理24h后,经流式法和Hoechst染色检测,细胞凋亡没有明显增加。利用beclin1 siRNA降低细胞中自噬关键因子beclin 1的表达发现,沉默beclin 1的表达可以抑制Aβ诱导的细胞自噬；同时沉默beclin 1的表达可以明显降低Aβ对SH-SY5Y的细胞毒性。1.5 Aβ25-35诱导的自噬由mTOR信号通路介导。Aβ处理SH-SY5Y细胞4h后,与对照组相比,细胞内mTOR的作用底物p70S6K的磷酸化水平降低,P-P70S6K/P70S6K比值降低。2.甲基牛扁亭MLA保护SH-SY5Y细胞拮抗Aβ的细胞毒性及其作用机制2.1 MLA预处理可改善Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞存活率的下降。与对照组相比,5μM、10μM MLA预处理SH-SY5Y细胞可明显抑制Aβ引起的细胞存活率的降低。同时,我们还观察到,2.5μM、5μM、10μM、20μM MLA处理细胞后,细胞存活率无明显改变,说明其有良好的安全性。2.2 MLA预处理可减弱Aβ25-35诱导的自噬。5μ MMLA预处理可减轻10μMA β外源性干预引起的SH-SY5Y细胞内LC3-Ⅱ的增加；同时,还可以抑制Aβ引起的细胞内MDC标记酸性膜泡数量的增加。2.3 MLA预处理通过增强mmTOR信号通路,从而抑制A β 25-35诱导的自噬。5μMMLA预处理可拮抗Aβ引起的SH-SYSY细胞内mTOR的底物p70S6K的磷酸化水平降低,p-P70S6K/P70S6K比值降低。结论1.Aβ可以引起SH-SY5Y细胞毒性作用,减少细胞存活率,呈一定剂量和时间依赖性。2.Aβ可以诱导SH-SY5Y细胞自噬增强,主要是通过增强自噬的形成,对自噬成熟过程并没有明显影响。3.Aβ引起的SH-SY5Y细胞存活率下降与其诱导的自噬增强密切相关,干扰细胞内自噬形成,可减弱Aβ诱导的细胞毒性作用。4.Aβ诱导的SH-SY5Y细胞自噬增强由mTOR信号通路介导。5.MLA可以减轻Aβ引起的SH-SY5Y细胞存活率的下降,对细胞起到保护作用。6.MLA可以减弱Aβ25-35诱导的细胞自噬增强,其作用机制与mTOR信号通路密切相关。
【关键词】：阿尔茨海默氏病 Aβ 自噬 MLA mTOR
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要6-11
• ABSTRACT11-16
• 缩略词表16-17
• 前言17-31
• 第一部分 Aβ诱导SH-SY5Y细胞毒性及其作用机制31-53
• 1. 前言31-32
• 2. 材料试剂及主要仪器设备32-34
• 3. 主要试剂配方34-39
• 4. 实验方法39-44
• 5. 实验结果44-46
• 6. 讨论46-48
• 附图48-53
• 第二部分 甲基牛扁亭MLA保护SH-SY5Y细胞拮抗Aβ的细胞毒性及其作用机制53-63
• 1. 前言53-54
• 2. 材料试剂及主要仪器设备54
• 3. 主要试剂配方54
• 4. 实验方法54-55
• 5. 实验结果55-56
• 6.讨论56-59
• 附图59-63
• 结论63-64
• 参考文献64-73
• 英文文章73-109
• 致谢109-110
• 攻读学位期间发表的学术论文110-111
• 附件111

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