血管性认知功能障碍小鼠海马区小胶质细胞极化与白质损伤的研究
发布时间：2017-11-07 02:13
本文关键词：血管性认知功能障碍小鼠海马区小胶质细胞极化与白质损伤的研究
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【摘要】：血管性认知障碍(vascular cognitive impairment,VCI)是指脑血管损伤所致的认知功能障碍,2011年美国心脏学会(American heart association,AHA)联合美国卒中学会(American stroke association,ASA)发布的VCI诊断标准包括三个要点:即认知功能障碍的存在、脑血管疾病的证据及脑血管疾病与认知障碍存在相关性,另外规定VCI是血管源性所致从轻度认知功能损害到痴呆的认知功能缺损全过程,因此我们可以认为VCI具有持续性、进展性的特点。VCI一旦发生,根据现在的医疗水平,我们无法阻断疾病的发展进程,VCI加重的后果则是给社会及家庭戴上了沉重的经济和精神枷锁。然而我们对脑血管疾病致认知功能障碍发生的机制并未完全了解。在临床研究中,过去的30年里大量研究表明磁共振T2序列上的脑白质高信号(white matter hyperintense,WMH)与认知功能障碍存在重要联系,常提示脑白质损伤(white matter lesions,WMLs)。Shibata等人的动物研究发现慢性脑灌注不足成功的导致了脑白质的受损,并观察到在第30天时,动物的工作记忆受损与脑白质的损伤是同时出现的。因此,脑缺血所致的白质损伤,即髓鞘或少突胶质细胞损伤是VCI发生的重要原因。那么,有哪些因素对髓鞘损伤和修复产生了重要的影响呢?小胶质细胞作为脑组织主要的炎症参与细胞,释放的大量炎症因子与脑白质受损不无关联,但除了炎症,小胶质细胞活化可能还存在其他的下游机制导致认知功能障碍的发生。我们的前期研究发现,小胶质细胞一方面与VCI的髓鞘损伤密切相关,一方面对髓鞘的生成又是必须的,这是一个看似矛盾的地方。结合近年来发现的小胶质细胞活化的两种形态:产生促炎因子的M1型、产生抗炎因子的M2型,即小胶质细胞的“极化”,我们推测,缺血引起的大脑内环境紊乱激活了小胶质细胞,并通过某条通路使得小胶质细胞更多向M1型活化,进一步引起了炎症因子的释放,最终导致了VCI的发生。那么,是什么机制调控了小胶质细胞的极化方向呢?有研究表明Fractalkine/CX3CR1通路可能在这一过程中发挥重要作用,而本课题希望就此进行相关研究。因此,我们提出假说,Fractalkine/CX3CR1通路调控的小胶质细胞极化在VCI的发生过程中起到了重要作用。本研究拟通过双侧颈动脉缺血法制备不同缺血时间的血管性认知功能障碍小鼠模型,应用Morris水迷宫实验对小鼠认知行为变化进行观察并挑选行为与病理表现更为稳定的模型,采用免疫组化、蛋白免疫印迹、免疫荧光双标等技术对髓鞘脱失程度、小胶质活化情况、小胶质细胞极化情况等进行检测,探讨小胶质细胞的极化参与VCI发生的机制,为VCI的治疗提供新的思路和靶点。方法第一部分:血管性认知障碍小鼠模型的建立与髓鞘损伤的研究成年雄性健康icr小鼠,随机分为模型组(vci)和假手术组(sham),vci组24只,sham组8只;vci组再随机分为缺血10分钟组(vci-10min),缺血30分钟组(vci-30min),缺血60分钟组(vci-60min)。模型组0.3%戊巴比妥麻醉后采用双侧颈动脉夹闭法制备血管性认知功能障碍小鼠模型,缺血时间各组不同。假手术组除不阻断供血外其余手术操作同模型组。术后第7天至第10天行morris水迷宫实验检测认知功能。认知功能测试结束后处死灌杀取脑,制备石蜡切片后行劳克坚劳蓝(luxolfastblue,lfb)染色、髓鞘碱性蛋白(myelinbasicprotein,mbp)及谷胱甘肽s转移酶(glutathiones-transferase,gst-pi)免疫组化染色,观察术后第10天海马区髓鞘脱失程度、少突胶质细胞以及胼胝体白质损伤情况。第二部分:血管性认知障碍小鼠海马区小胶质细胞极化的研究成年雄性健康icr小鼠,随机分为模型组(vci)和假手术组(sham);采用随机数法随机将vci组小鼠分为术后1天(vci-24h)、术后7天(vci-7d)和术后15天(vci-15d)三个亚组,每个亚组16只。假手术组48只,分别于术后1、7、15天随机提取16只。模型组0.3%戊巴比妥麻醉后采用双侧颈动脉夹闭法制备血管性认知功能障碍小鼠模型,双侧颈动脉缺血时间为60分钟;假手术组除不阻断双侧颈动脉血流,其余步骤同模型组。术后24小时、术后第7天、术后第15天,分别对各亚组模型小鼠与假手术组小鼠进行灌注取脑,分别制备石蜡切片及海马组织蛋白匀浆。取石蜡切片进行cd11b/inos(induciblenitricoxidesynthase,诱导型氮氧化物合酶)及arg-1(arginase-1,精氨酸酶-1)免疫荧光染色,及海马匀浆蛋白免疫印迹观察vci模型的小胶质细胞激活情况,进行小胶质细胞向m1型或m2型极化方向的研究,以及fractalkine/cx3cr1信号通路的研究。结果第一部分:血管性认知障碍小鼠模型的建立与髓鞘损伤的研究vci小鼠术后术后第9天(postoperationday,pod)找到平台潜伏期时间(latency)延长(假手术组18.07±5.86s,缺血60min组41.90±4.52s,t=㧟9.11,p=0.000)。四组小鼠pod9时找到站台潜伏期差异有统计学意义(假手术组18.07±5.86s,缺血10min组26.64±9.37s,缺血30min组33.44±6.65s,缺血60min组41.90±4.52s,f=17.52,p=0.000),四组小鼠空间探索试验目标象限活动时间存在差异(假手术组26.15±6.02s,缺血10min组22.08±3.49s,缺血30min组20.67±3.53s,缺血60min组12.22±2.26,f=16.63,p=0.000),与假手术组相比,缺血10min组目标象限活动时间下降不明显(p0.05),缺血30分钟组、缺血60分钟组减少(p0.05)。mbp免疫组化染色结果:四组小鼠mbp染色积分光密度值(integratedopticaldensity,iod)与假手术组平均iod比值差异有统计学意义(假手术组1.00±0.07,缺血10min组0.71±0.08,缺血30min组0.53±0.08,缺血60min组0.29±0.13,f=82.28,p=0.000),与假手术组相比,缺血10min组、缺血30min组、缺血60min组mbp染色iod与假手术组平均iod比值减少(p0.05)。lfb染色结果提示:四组小鼠lfb染色iod与假手术组平均iod比值差异有统计学意义(假手术组1.00±0.32,缺血10min组0.82±0.16,缺血30min组0.62±0.12,缺血60min组0.40±0.19,f=12.16,p=0.000),与假手术组相比,缺血10min组减少不显著(p0.05),缺血30min组、缺血60min组减少(p0.05)。gst-pi免疫组化染色结果:四组小鼠gst-pi阳性细胞数差异有统计学意义(假手术组23.02±4.83/mm~2,缺血10min组21.01±2.14/mm~2,缺血30min组18.08±2.01/mm~2,缺血60min组15.03±1.66/mm~2,f=11.22,p=0.000),与假手术组相比,缺血10min组gst-pi阳性细胞数无明显差异(p0.05),缺血30min组、缺血60min组gst-pi阳性细胞数均减少(p0.05)。第二部分:血管性认知障碍小鼠海马区小胶质细胞极化的研究与假手术组小鼠相比,vci组小鼠海马匀浆的cd11biod与内参iod比值明显增加(假手术组0.21±0.11,vci-15d组0.61±0.17,t=㧟5.66,p=0.000)。四组小鼠海马匀浆inos条带iod与内参iod比值差异有统计学意义(假手术组1.04±0.13,vci-24h组0.99±0.09,vci-7d组1.13±0.08,vci-15d组1.17±0.17,f=3.37,p=0.032),与假手术组相比,vci-24h组inos条带iod与内参iod比值减少不显著(p0.05)vci-7d组、vci-15d组inos条带iod与内参iod比值有所增加,但不显著(p0.05),但vci-15d组inos条带iod与内参iod比值较vci-24h组增加且差异有统计学意义(p0.05)。四组小鼠海马匀浆arg-1条带iod与内参iod比值差异有统计学意义(假手术组0.82±0.08,vci-24h组0.96±0.14,vci-7d组0.94±0.11,vci-15d组0.64±0.26,f=6.35,p=0.002),与假手术组相比,vci-24h组、vci-7d组arg-1条带iod与内参iod比值增加不显著(p0.05),vci-15d组arg-1条带iod与内参iod比值明显降低(p0.05)。免疫荧光染色结果:与假手术组相比,VCI-15d组CD11b/i NOS双染阳性细胞数量增加,具有统计学差异(假手术组15.66±0.78/mm~2,VCI-15d组22.11±2.27/mm~2,t=㧟7.62,P=0.000)。与假手术组相比,VCI-15d组Arg-1阳性细胞数量减少,具有统计学差异(假手术组19.18±2.45/mm~2,VCI-15d组12.18±2.16/mm~2,t=6.06,P=0.000)。Fractalkine/CX3CR1信号通路蛋白免疫印迹结果:与假手术组相比,VCI-15d组小鼠海马匀浆中CX3CL1条带IOD与内参IOD比值上升(假手术组0.23±0.12,VCI-15d组0.47±0.22,t=㧟2.83,P=0.013),VCI-15d组小鼠海马匀浆中CX3CR1条带IOD与内参IOD比值上升(假手术组0.32±0.11,VCI-15d组0.45±0.10,t=㧟2.60,P=0.021),VCI-15d组核转录因子κB-p50(Nuclear Factor-Kappa B,NF-κB)条带IOD与内参IOD比值明显增加(假手术组0.46±0.14,VCI-15d组0.78±0.12,t=㧟5.01,P=0.000),VCI-15d组环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP Response Element-Binding Protein,CREB)条带IOD与内参IOD比值增加不显著(假手术组0.11±0.05,VCI-15d组0.13±0.09,t=㧟0.60,P=0.56)。结论通过调控双侧颈动脉不同缺血时间建立并比较不同缺血时间的血管性认知障碍小鼠模型,证明短暂性脑缺血即可出现少突胶质细胞及髓鞘损伤,以及认知功能障碍。然而缺血60分钟所致损伤更为明显、稳定,是研究小胶质细胞极化的合适模型。通过对VCI模型的小胶质细胞激活情况的观察,小胶质细胞向M1型与M2型极化方向的研究,以及对Fractalkine/CX3CR1信号通路的研究,表明在脑缺血情况下,VCI动物脑内的小胶质细胞激活,主要为M1型,Fractalkine/CX3CR1信号通路激活,主要向NF-κB方向导致M1型激活,从而引起促炎反应导致髓鞘损伤。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.13
【参考文献】
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1 李海龙;郑惠文;刘敏;黎佳思;王云霞;赵善民;毕晓莹;;血管性认知障碍小鼠脑内少突胶质细胞再生分化障碍特点研究[J];中国卒中杂志;2015年11期
，本文编号：1150388
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/jsb/1150388.html
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