外周肌肉转染p75ECD基因对阿尔茨海默病的预防作用及机制研究

发布时间：2017-11-08 17:00

  本文关键词：外周肌肉转染p75ECD基因对阿尔茨海默病的预防作用及机制研究

  更多相关文章： p75ECD 阿尔茨海默病 Aβ AAV 肌肉转染

【摘要】：背景和目的阿尔茨海默病是老年人最为常见的神经退行性疾病,以进行性认知功能减退为主要临床特征。目前尚无有效手段或药物来延缓或逆转阿尔茨海默病的疾病进程,成为困扰医学科研的世界性难题。β淀粉样蛋白(Amyloid-beta,Aβ)作为阿尔茨海默病的核心致病物质,在疾病的发生发展过程中起到了重要作用。有鉴于此,Aβ也成为首要治疗靶点。然而,Aβ的产生和代谢调节机制尚不完全清楚。同时,神经营养因子及其相关受体失调在散发性阿尔茨海默病的病理发生过程中具有重要的调控作用,研究表明,阿尔茨海默病患者存在神经营养因子和Trk受体下调现象,而与之相反的是,Aβ,神经营养因子前体蛋白和相关受体如proNGF、p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)和sortilin等神经退行性信号表达上调。p75NTR通过激活不同的共受体,介导发育过程中神经元存活或神经元凋亡两个完全相反的作用。p75NTR在生理条件下,能够被α-肿瘤坏死因子α转换酶(tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme,TACE)水解释放其胞外段(p75 neurotrophin receptor ectodomain,p75ECD),C端随后被γ分泌酶进一步剪切生成胞内段(intracellular domain,ICD)。以往研究表明,p75NTR在阿尔茨海默病病理机制中有两方面的作用,一方面,p75NTR能够与Aβ相结合,介导神经元凋亡,同时可正反馈的促进Aβ过度产生、聚集;另一方面,p75ECD是一个生理性的神经保护因子,我们过去的研究证实,通过脑内基因转染人p75ECD以提高脑内p75ECD水平,可以减少Aβ产生,拮抗其神经毒性作用,抑制Aβ脑内沉积,表明p75ECD具有AD防治潜力。对于Aβ的清除,过去的研究主要聚焦在使药物进入脑内而发挥作用。然而,在抗Aβ免疫治疗中,抗体进入脑内可诱发一系列副作用,包括自身免疫性脑炎、血管源性脑水肿、扬灰效应等。我们近期研究发现,脑组织中约40%的Aβ能够从脑内流入外周循环,而后被外周器官清除。Aβ外周清除是保持脑组织Aβ维持动态平衡的有效机制。从外周途径来清除脑内Aβ是一条更为安全和简便的潜在途径。因此,我们探讨通过外周肌肉转染表达p75ECD,来清除脑内Aβ的作用和相关机制,并初步观察评价其安全性。材料与方法我们首先通过硫磺素t实验与透射电镜实验在体外水平探讨p75ecd对aβ纤维的抑制聚集能力和促进已经聚集的aβ纤维解聚能力;然后,我们通过肌肉注射aav病毒载体转染表达p75ecd基因,将app/ps1转基因小鼠(ad小鼠)分为p75ecd转染表达组、转染对照组和ad空白对照组和野生型小鼠对照组,于ad小鼠3月龄时肌肉注射aav病毒,转染对照组注射aav-gfp(绿色荧光蛋白),所有试验组小鼠于12月龄时通过morris水迷宫、y迷宫和旷场实验检测学习记忆能力情况,通过刚果红染色、6e10免疫组织化学染色和elisa、免疫印迹等方法进行定量分析不同组间ad相关病理变化情况、beta-淀粉样蛋白的变化情况等,观察p75ecd对ad小鼠的预防作用,并进一步在整体水平和离体细胞培养水平(sh-sy5y细胞系和皮质神经元原代培养)探讨相关机制,最后观察实验过程中小鼠的行为、饮食等日常活动,通过he染色和elisa等方法检测分析比较小鼠病理变化、体重、代谢和自身免疫水平变化情况,以初步评价外周转染表达p75ecd的安全性。连续性变量以mean±s.e.m.表示,重复测量数据(如水迷宫逃逸潜伏时间和游泳距离)分析采用two-wayanova分析;其余多组间比较采用one-wayanova分析。非正态分布数据采用非参检验。当p0.05,我们认为差异具有统计学意义。结果1.p75ecd能够抑制aβ聚集、促进aβ纤维解聚。体外实验中,我们通过硫磺素t实验与透射电镜实验观察p75ecd与aβ相互作用情况。实验结果显示,p75ecd处理后,aβ聚合物聚集的纤维稀疏、散乱,而已经形成的aβ聚合纤维中加入p75ecd处理一段时间后,发现原本排列较致密的纤维发生崩解、形态结构松散,数量减少。而等剂量的huigg-fc、fgfr4-fc却不影响aβ的聚集和解聚。因此,研究表明p75ecd对aβ具有抑聚、解聚能力。2.外周肌肉转染p75ecd基因,主要在外周肌肉组织表达、分布。研究中我们通过基因工程方法将p75ecd-fc基因整合到腺相关病毒-8(aav-8),构建了aav-p75ecd-fc质粒,并将该质粒注射到3月龄ad小鼠小鼠左后肢股内侧肌,以达到转染目的。我们在注射后不同时间点检测p75ecd-fc表达水平,免疫组化结果显示p75ecd-fc基因在ad小鼠的左后肢肌肉中稳定持续表达,elisa检测发现p75ecd在血浆中较对照组显著升高。上述实验表明,外周转染p75ecd-fc基因后,肌肉是其主要表达部位,表达的p75ecd-fc蛋白主要分布在外周,未进入脑内。3.外周肌肉转染p75ecd基因改善app/ps1小鼠认知功能我们通过morris水迷宫、y迷宫和旷场实验等行为学实验检测发现,与gfp对照组相比较,p75ecd-fc组ad小鼠表现更佳,具体体现在morris水迷宫中逃逸潜伏期和平台逃逸距离显著降低,y迷宫实验中自发交替反应次数和新臂进入次数明显增加,旷场实验中小鼠移动距离更长。行为学实验表明外周转染p75ecd能够显著改善ad小鼠的空间学习记忆能力,工作记忆能力和自主探索能力,小鼠认知功能损害得到了修复。4.外周肌肉转染p75ecd基因降低app/ps1小鼠aβ水平刚果红和免疫组织化学染色发现p75ecd组小鼠皮层和海马内的aβ斑块明显减少,elisa分析发现可溶性aβ、疏松aβ纤维斑块、致密aβ斑块和血浆中aβ变化与免疫组化结果保持一致。bace1是aβ代谢过程中的限速酶,可以和γ-分泌酶一起将app剪切生成aβ。实验中发现p75ecd能够抑制bace1表达及其活性,减少app的aβ代谢途径。western-blot检测发现aβ的主要降解酶(nep,ide)和主要跨血脑屏障转运蛋白(lrp、rage)均未见明显改变。原代神经元培养实验中,aβ42能够显著促进bace1和sapp表达,两者之间存在着剂量依赖关系。如果加入重组的p75ecd-fc或敲除p75ntr基因,这种效应便会不复存在。以上实验结果表明,p75ntr参与了app的aβ代谢途径,是aβ上调bace1表达调控中的关键受体,在aβ-bace1恶性循环中发挥了重要作用,促进了ad的发生发展,而p75ecd能够阻断aβ-bace1恶性循环。5.外周肌肉转染p75ecd基因减轻app/ps1小鼠tau磷酸化水平免疫组化图片和分析结果显示,p75ecd组ad小鼠海马tau-phospho-ser396阳性神经元面积比对照组显著降低,这与wb分析其他tau磷酸化位点(serine396,262,199,threonine231)得到的结果相一致。通过sh-sy5y细胞实验,我们发现aβ能够上调gsk3β活性而加剧tau过度磷酸化,重组的p75ecd可以竞争性与aβ结合而抑制tau磷酸化反应。6.外周肌肉转染p75ecd基因抑制app/ps1小鼠炎症反应gfap和cd45免疫组化染色结果显示,p75ecd组ad小鼠大脑皮层和海马中活化的星形胶质细胞和小胶质细胞阳性面积明显少于对照组。p75ecd组脑组织tbs提取物和血浆中的炎症因子(il-1β,il-6,ifn-γ和tnf-α)水平均呈下降趋势,说明p75ecd可以抑制ad小鼠的神经胶质细胞活化,减轻炎症反应。7.外周肌肉转染p75ecd基因预防ad途径安全整个动物实验过程中,所有动物健康状况良好,未出现死亡或明显行为异常。我们在本研究中专门评价了外周转染p75ecd后小鼠脑和外周器官可能存在的副作用,he染色未发现大脑皮层、海马,肝、肺、肾、脾、肌肉和小肠等主要器官存在异常病理变化。动物饮食、体重和代谢酶(AST,ALT)也未见明显差异。另外,为了评估p75ECD受否会导致自身免疫反应,我们通过ELISA检测了p75ECD组、GFP对照组和野生型小鼠血浆中p75ECD自身抗体(p75ECD-Ab)水平,结果发现三组之间无显著差异,且p75ECD-Ab水平很低。这些资料说明p75ECD在体内长期表达没有对小鼠机体带来明显的副作用,表明AAV外周转染p75ECD防治AD的方法是安全的。结论1.p75ECD能够抑制Aβ聚集、促进Aβ纤维解聚。2.AD小鼠外周肌肉转染p75ECD基因后能够有效清除脑内Aβ,并减轻AD相关病理损害,改善学习记忆障碍。3.外周肌肉转染p75ECD基因是一条潜在的安全有效的AD防治途径。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 逢迎春　,王寿先,宋保华;早年生活危险因素与阿尔茨海默病的发生[J];国外医学(儿科学分册);2000年06期

2 ;阿尔茨海默病患者常有额叶损害[J];河南医学研究;2000年03期

3 柴延丰,陈哲宇;阿尔茨海默病研究又有新进展[J];中国神经科学杂志;2000年04期

4 菲琳;;可缓解阿尔茨海默病病情的新药[J];国外医学情报;2000年02期

5 汪义朋,王建枝;早老素-1对阿尔茨海默病相关蛋白调节的可能途径[J];中华神经科杂志;2001年01期

6 邵千里;15例阿尔茨海默病的诊治[J];贵阳医学院学报;2001年03期

7 ;工业化社区阿尔茨海默病发病率较高[J];河南医学研究;2001年03期

8 邵梅,汤荟冬;阿尔茨海默病天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶研究进展[J];上海第二医科大学学报;2001年05期

9 ;脑器质性精神障碍[J];国外科技资料目录.医药卫生;2001年04期

10 吴传深 ,周东丰 ,Peter Como ,张林 ,Karl Kieburtz ,范金虎 ,乔友林;河南林县阿尔茨海默病患病率的调查[J];中华精神科杂志;2002年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 陈梅芳;;阿尔茨海默病的行为和精神症状及相关因素分析[A];2009年浙江省医学会精神病学学术年会暨浙江省医师协会精神科医师分会第二届年会论文汇编[C];2009年

2 杜丽华;;阿尔茨海默病治疗[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

3 成林平;黄绍宽;李玉梅;王延平;邓晓莹;;维生素干预治疗对阿尔茨海默病患者血浆同型半胱氨酸水平的影响[A];中华医学会第八次全国老年医学学术会议论文汇编[C];2007年

4 唐微韵;;阿尔茨海默病患者照料工作中的心理慰藉问题探讨[A];第10次全国精神病学术交流会暨《中国民康医学》创刊20周年庆典论文汇编[C];2008年

5 周东升;徐银儿;连国民;于畅;陈中鸣;;老年人生活方式与阿尔茨海默病相关性研究[A];2013浙江省医学会精神病学分会学术年会暨浙江省医师协会精神科医师分会第六届年会论文汇编[C];2013年

6 于恩彦;;对阿尔茨海默病认识的进展[A];2013年浙江省医学会精神病学分会老年精神障碍学组学术会议论文汇编[C];2013年

7 郭忠伟;陈炜;;~1H-MRS在阿尔茨海默病早期诊治中的应用[A];2013年浙江省医学会精神病学分会老年精神障碍学组学术会议论文汇编[C];2013年

8 于恩彦;朱俊鹏;王珏;王欣慰;谭云飞;廖峥娈;仇雅菊;汪宏;;阿尔茨海默病的“早期-全面-系统-长期”预防[A];第七届全国心理卫生学术大会论文汇编[C];2014年

9 崔德华;;脑衰老因素在阿尔茨海默病的发病中的所起的作用及防治[A];2009全国抗衰老与老年痴呆学术会议论文汇编[C];2009年

10 陈生弟;杨红旗;孙治坤;崔佩菁;王红梅;;阿尔茨海默病的若干发病机制及治疗新靶点研究[A];2009全国抗衰老与老年痴呆学术会议论文汇编[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 编译 姚立新;阿尔茨海默病防治:缺乏灵丹妙药[N];医药经济报;2010年

2 记者 刘正午;阿尔茨海默病成欧美第二大忧患[N];医药经济报;2011年

3 长沙市第一医院神经医学中心主任、主任医师 王爱民;您了解阿尔茨海默病吗？[N];大众卫生报;2012年

4 长沙市第一医院神经医学中心主任、主任医师 王爱民;门诊可排查阿尔茨海默病[N];大众卫生报;2012年

5 本报记者 李颖;为阿尔茨海默病正名[N];科技日报;2012年

6 上海市中医老年医学研究所教授 林水淼;阿尔茨海默病权变治疗可延缓病情进展[N];健康报;2013年

7 吴志 李淼;警惕盯上老年人的“杀手”阿尔茨海默病[N];科技日报;2013年

8 孙琳 本报记者 李颖;你是否关注阿尔茨海默病？[N];科技日报;2014年

9 本报记者 李蕴明;阿尔茨海默病困局待解[N];医药经济报;2014年

10 樱子 整理;为何阿尔茨海默病患者常迷路[N];医药经济报;2014年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 吕英茹;阿尔茨海默病的MRI结构与功能研究[D];复旦大学;2014年

2 杨平;中国南方人群阿尔茨海默病易感基因筛查及可能机制[D];复旦大学;2014年

3 李毅;FDG和PiB PET显像在Alzheimer's Disease早期诊断及临床分型中的应用研究[D];山东大学;2015年

4 矫树生;依达拉奉对阿尔茨海默病的防治作用及其机制研究[D];第三军医大学;2015年

5 李工博;杀虫剂DDT和hnRNPA1基因在阿尔茨海默病中的作用及分子机制研究[D];第三军医大学;2015年

6 邓青山;DISC1改善阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因模型鼠认知功能的实验研究[D];南方医科大学;2015年

7 朱小群;磁共振波谱在轻度认知功能损害和阿尔茨海默病中的应用[D];安徽医科大学;2015年

8 姜红燕;云南汉族早发阿尔茨海默病家系的遗传学研究[D];云南大学;2015年

9 徐志鹏;糖原合成酶激酶-3β在阿尔茨海默病及2型糖尿病发病中的作用[D];华中科技大学;2015年

10 李楠;人源性阿尔茨海默病噬菌体抗体库的构建及Aβ单链抗体的筛选与初步效价研究[D];郑州大学;2016年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 蒋刚;蚁群算法在求解阿尔茨海默病最优微阵列上的应用[D];四川师范大学;2011年

2 周江霖;应用点着色聚类方法识别阿尔茨海默病致病基因[D];四川师范大学;2012年

3 方杰;IL-17在阿尔茨海默病中的作用及机制研究[D];福建医科大学;2015年

4 张颖超;5-氨基吡唑-3-酮衍生物的合成及其生物活性测试[D];河北大学;2015年

5 付成燕;护士对阿尔茨海默病的认知及其影响因素的研究[D];泰山医学院;2014年

6 娄艳芳;非药物疗法干预阿尔茨海默病的临床疗效研究[D];河北医科大学;2015年

7 郭耀鹏;亲环素D抑制剂对阿尔茨海默病杂种细胞线粒体功能缺陷的保护作用[D];兰州大学;2015年

8 王婧;基于基因芯片微阵列数据的可比性识别阿尔茨海默病的候选基因[D];四川师范大学;2015年

9 陈影影;对DNA微阵列数据的聚类以识别阿尔茨海默病的相关基因[D];四川师范大学;2015年

10 阎艳;阿尔茨海默病及轻度认知功能障碍患者血清相关激素水平的改变及其临床意义[D];苏州大学;2015年

，

本文编号：1157991