可用于Aβ检测的双抗体夹心ELISA方法研究

发布时间：2017-11-13 12:28

  本文关键词：可用于Aβ检测的双抗体夹心ELISA方法研究

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【摘要】：目的：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种与衰老相关的神经系统退行性疾病,其发病机制并不清楚,目前尚无有效的治疗方法。淀粉样蛋白(β-amyloid peptide, Aβ)是主要的AD使动因子,而体液中Ap的检测也成为AD早期诊断的重要指标之一。本研究旨在探讨建立可用于Ap检测的双抗体夹心ELISA (double antibody sandwich ELISA, DAS-ELISA)的方法。方法：(1)Ap标准品的鉴定：通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)检测体外组装形成的可溶性Aβ40/42标准品；对样品负染色后,采用透射电子显微镜技术(transmission electron microscopy, TEM)观察其形貌；用间接ELISA检测其免疫反应性。 (2)抗体的大量制备和性质鉴定：复苏并培养分泌候选单克隆抗体(AC-1、AC-2、AN-1和ACE-1)的杂交瘤细胞株(前期实验已经建立),诱生小鼠腹水并用亲和层析的方法纯化大量制备的单克隆抗体(以下简称“单抗”),同时制备必要的兔源多克隆抗血清(以下简称“多抗血清”)。以间接ELISA检测抗体识别抗原的特异性、滴度以及灵敏度。(3)单抗标记：采用生物素(biotin)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记法,并通过间接ELISA检测标记后抗体的活性。(4)抗体配对筛选及DAS-ELISA方法的建立：优化包被条件、包被抗体和检测抗体的浓度等,筛选适用的抗体配对组合,测试所建立的DAS-ELISA体系的检测灵敏度。结果：(1)SDS-PAGE结果显示,体外组装的可溶性Aβ40/42标准品的分子量大小在7-17 kD之间；TEM图像显示,其形态呈球形或串珠状；间接ELISA结果显示,只有Aβ42被12F4(商品化的Aβ42特异性单抗)识别。 (2)单抗AC-1特异性识别Aβ40,而AC-2特异性识别Aβ42：单抗AC-1、AC-2、AN-1和ACE-1滴度分别为1：512000、1：1024000、1：2048000以及1：256000,多抗血清BJD-002和BJD-004滴度均为1：2048000：单抗AC-1、AC-2、AN-1和ACE-1灵敏度分别为最低可检出31.2 ng/mL、125ng/L、62.5 ng/mL以及20 ng/mL的抗原,多抗血清BJD-002和BJD-004灵敏度分别为最低可检出31.2 ng/mL和250ng/mL的抗原。(3)获得了4个活性标记单抗,分别是AC-1-HRP、AC-2-biotin、 AN-1-biotin和ACE-1-HRP,可用于抗体配对筛选。(4)确定最佳包被液为pH7.4的Tris-HCl缓冲液,包被抗体浓度为5 μg/mL;成功得到4组抗体配对,其中ACE-1/AC-1-HRP特异性识别Aβ40, AN-1/AC-2-biotin特异性识别Aβ42。结论：本研究成功筛选到识别不同Ap组分的抗体配对,并优化了DAS-ELISA检测的条件,为进一步的研究提供了实验基础。
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16;R446.6

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本文编号：1180709