自闭症相关基因Shank3在大脑皮层锥体神经元发育中的作用机制研究

发布时间：2017-11-21 01:05

  本文关键词：自闭症相关基因Shank3在大脑皮层锥体神经元发育中的作用机制研究

  更多相关文章： Shank3 发育 大脑皮层 锥体神经元 自闭症

【摘要】：背景自闭症是一类由严重的神经发育失调而导致的广泛性发育障碍疾病。其主要表现为社会交往障碍、言语发育障碍,以及行为方式刻板和兴趣狭窄。近年来因自闭症发病率逐年攀升,社会负担大等原因已引起广泛关注。目前,自闭症是一类多因素导致的神经发育障碍性疾病已得到公认,然而自闭症的神经发育学机制依然尚未阐明。因此,对自闭症行为相关神经环路的探索,尤其是从发育角度的研究已然成为探索自闭症发病机制和治疗手段的重要方向及突破口。目前对于自闭症发病的基因学研究已取得较多进展,发现了众多可能的与自闭症发病密切相关的危险基因,如MeCP2,FMR1,PTEN,NF1,UBE3A,Shank3等。其中通过对自闭症病人的基因学研究表明,位于人染色体22q13.3上的Shank3基因突变是导致自闭症发病的重要因素之一。本课题选取Shank3基因作为研究的切入点,其编码的兴奋性突触后致密体折叠蛋白可以与突触后谷氨酸受体及信号分子和骨架蛋白桥联而发挥作用。研究表明Shank3在兴奋性突触的形成和维持谷氨酸受体功能中起重要作用,并且Shank3基因敲除的小鼠可出现明显的自闭样行为。然而Shank3如何参与大脑,尤其是大脑皮层发育过程呢?以及在自闭症模型中,Shank3如何在发育过程中累及皮层神经元发育从而诱发自闭样行为?解答以上问题对于深入阐明自闭症的发育学机制至关重要。.本课题将对此进行探讨。目的1.观察Shank3蛋白在成年小鼠大脑皮层内的表达分布模式及细胞化学特点。2.研究Shank3基因在小鼠大脑皮层不同发育时期的表达变化及分布特点。3.观察Shank3基因对小鼠大脑皮层锥体神经元树突发育的影响。4.探索Shank3基因对小鼠大脑皮层不同发育期兴奋性突触功能的影响。方法1.利用免疫荧光染色技术观察Shank3免疫阳性分子在大脑皮层组织内的分布及细胞化学特点。2.懫用荧光定量PCR技术检测不同发育时期小鼠大脑皮层内Shank3 mRNA的表达量变化。3.应用Western Blot技术检测不同发育时期Shank3蛋白在大脑皮层内的表达量变化。4.构建Shank3下调质粒,并通过胚胎电转技术,观察Shank3基因表达下调后对锥体神经元发育的影响。5.引入Shank3B KO小鼠,应用Golgi染色技术,并通过sholl分析观察Shank3基因敲除对不同发育期锥体神经元树突分支的影响。6.联合传统Golgi染色技术-共聚焦成像-Imaris重塑方法,观察Shank3基因敲除对不同发育期锥体神经元树突棘的影响。7.基于Shank3 KO转基因动物模型,利用离体脑片电生理膜片钳记录方法,探讨Shank3敲除对不同发育期大脑皮层兴奋性突触功能的影响。结果1.成年小鼠大脑皮层内,Shank3免疫阳性细胞在前扣带回皮层(ACC)和感觉区皮层(S)内,分布广泛且成高表达;而在大脑皮层其他区域的细胞中,Shank3的表达量很低。2.成年小鼠大脑皮层中,Shank3与Ibal和GFAP在细胞中不存在共存情况;表达Shank3的细胞几乎都表达NeuN,而表达NeuN的细胞并非全部表达Shank3;在神经元中Shank3分子和兴奋性投射神经元的标志物CaMKⅡ分子几乎全部共存,而与抑制性的GABA能神经元的标志物GAD67分子大多不共存。3.在ACC区和S区,Shank3免疫阳性分子在锥体神经元的胞体,顶树突和基树突中均有分布,而在其他区域,Shank3分子主要定位于神经元突起中。4.小鼠在出生前其大脑皮层内Shank3的mRNA的表达量很低,在出生后1周其表达量开始增加,到达2周后表达量显著增加,之后其表达趋于平稳。从胚胎期到出生后2周,小鼠大脑皮层内Shank3蛋白表达量稳定且较低,从3周开始,其表达量显著增加,之后趋于平稳。5.出生后1周,小鼠大脑皮层内,Shank3免疫阳性细胞分布主要集中于M2区及S区,从出生后2周开始,其免疫阳性细胞开始主要集中于ACC区,M区及S区,到达4周其分布和成年小鼠Shank3免疫阳性细胞分布几乎一致。6.应用胚胎电转方法,下调大脑皮层锥体神经元内Shank3基因的表达结果显示,小鼠出生后1周,其大脑皮层锥体神经元的形态没有发生改变。从出生后2周开始,锥体神经元的形态开始发生改变,表现为神经元突起缩短,并出现迂回突起,到达3周该现象更加明显。7.观察不同发育期Shank3B KO小鼠大脑皮层锥体神经元形态,发现出生后1周Shank3B KO小鼠较正常小鼠锥体神经元的顶树突和基树突长度和分支数及树突棘密度均没有发生改变。但出生后2周的Shank3BKO小鼠较正常小鼠锥体神经元的顶树突和基树突的长度缩短,基树突的分支数减少且树突棘密度减少。到达3周后,Shank3B KO小鼠的锥体神经元顶树突的长度显著缩短,并且基树突的分支数也显著减少,基树突和顶树突上树突棘数都明显减少。8.出生后1周的Shank3B KO小鼠ACC区锥体神经元sEPSC的幅度和频率均无显著变化,但AMPA受体介导的I-O曲线明显左移。出生后2周的Shank3B KO小鼠ACC区锥体神经元sEPSC的幅度和频率均减小,但AMPA受体介导的I-O曲线无明显变化。出生后3周的Shank3BKO小鼠ACC区锥体神经元sEPSC的幅度和频率均减小,且AMPA受体介导的I-O曲线明显左移。结论1.Shank3分子在大脑皮层内表达分布不均一,在特定区域表达量高。2.Shank3分子在大脑皮层不同发育阶段,其分布模式及表达量均不同。3.在小鼠出后1周时,Shank3基因对大脑皮层锥体神经元的树突发育及其功能几乎没有影响。4.在小鼠出生后2周及之后,Shank3基因对大脑皮层锥体神经元的树突发育及其功能影响显著。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.94

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本文编号：1209127