血管性认知功能障碍小鼠海马组织自噬相关蛋白表达变化及氯化锂的干预作用

发布时间：2017-11-22 11:23

  本文关键词：血管性认知功能障碍小鼠海马组织自噬相关蛋白表达变化及氯化锂的干预作用

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【摘要】：目的:血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment,VCI)是由各种脑血管疾病引起的以学习、记忆功能损害为主要症状的智能障碍综合征,其是一种慢性进行性疾病,可最终发展至不可逆转的程度。随着人口老龄化的加剧,VCI给个人、家庭以及社会带来沉重的负担,因而寻找一种有效的治疗药物刻不容缓。近年来许多研究表明,反复脑缺血再灌注损伤是VCI的主要病因之一,因此探讨反复脑缺血再灌注损伤致VCI的发病机制并寻求有效的治疗药物成为当前医学界的热点。反复脑缺血再灌注可诱导线粒体损伤,产生大量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),其可使功能异常的蛋白质及损害的细胞器积聚,从而激活自噬(autophagy),引起细胞自噬性死亡。研究表明糖原合成酶激酶-3β/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路(glycogen synthase kinase-3β/mammalian target of rapamycin,GSK3β/m TOR)在拮抗自噬过度激活中发挥着重要的作用。氯化锂(lithium chloride)一直用来治疗躁狂-抑郁性疾病,近年来研究证实氯化锂可改善神经退行性疾病及急性脑损伤诱导的认知功能障碍。尽管氯化锂对于改善认知功能具有多种机制,但其是否通过调控GSK3β/m TOR通路而抑制自噬改善认知功能障碍尚未见报道。我们课题组在前期研究中发现反复脑缺血再灌注损伤致VCI小鼠模型腹腔注射氯化锂2mmol/kg可磷酸化GSK3β,从而抑制GSK3β的活性。基于以上研究,本实验通过反复三次结扎双侧颈总动脉法建立VCI小鼠模型,观察小鼠术前预防性应用氯化锂或术后治疗性应用氯化锂能否改善认知功能,并进一步探讨其是否与通过激活m TOR通路而抑制自噬有关。方法:以8周龄24-26g雄性C57BL/6小鼠为研究对象,采用反复三次结扎双侧颈总动脉(bilateral common carotid artery,BCCA)的方法,给予脑缺血20min 再灌注10min处理,建立VCI小鼠模型。实验1:将小鼠随机分为假手术组和手术组,手术组按照术后不同时间点分为1d、3d、7d、14d、28d 5个亚组。将各组小鼠分别于相应时间点处死后,采用western blot观察VCI发病过程中m TOR、p-m TOR、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)蛋白水平的动态变化。实验2:将小鼠随机分为假手术组(Sham)、VCI模型组(Vehicle)、氯化锂预防组(Pre-Li)及氯化锂治疗组(Li)。假手术组和VCI模型组给予等体积生理盐水;氯化锂预防组术前腹腔注射氯化锂2mmol/kg连续7d,氯化锂治疗组术后腹腔注射氯化锂2mmol/kg连续14d。2周后各组通过Morris水迷宫实验进行学习和记忆成绩测试,观察其空间认知能力的变化。水迷宫测试结束后,采用尼氏染色观察各组小鼠海马组织病理学变化及透射电镜观察海马超微结构变化,应用western blot观察各组小鼠海马m TOR、p-m TOR、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达变化。结果:1空间认知能力变化—水迷宫结果1.1定位航行实验:各组小鼠寻台潜伏期随着训练天数逐渐缩短。VCI模型组小鼠与假手术组小鼠相比,从入水到找到平台的时间(寻台潜伏期)明显延长(P0.01);氯化锂预防组及治疗组小鼠较VCI模型组小鼠相比,寻台潜伏期明显缩短(P0.01)。1.2空间探索实验:选用目标象限停留时间百分比进行测定。与假手术组相比,VCI模型组小鼠在原平台所在象限(目标象限)停留时间所占百分比降低(P0.01),氯化锂预防组在原平台所在象限停留时间百分比较VCI模型组明显增加,具有统计学意义(P0.01),而氯化锂治疗组在原平台象限停留时间虽然较VCI模型组增加,但无统计学意义(P0.05)。2尼氏染色结果假手术组小鼠海马CA1区神经元排列紧密、均匀,无神经元丢失现象,结构完整,胞浆尼氏体丰富,胞核大而圆,核仁清晰可见。与假手术组相比,VCI模型组小鼠可见CA1区神经元部分缺失,且排列疏松,神经元形态不规则,胞体、胞核固缩。给予氯化锂干预后,上述情况得到明显改善,海马CA1区神经元丢失明显减少,可见少量胞核固缩。3海马CA1区神经元超微结构变化—透射电镜结果假手术组小鼠海马CA1区神经元结构完整,线粒体、内质网、高尔基体等细胞器丰富,且粗面内质网无脱颗粒现象,胞核完整,染色质均匀一致。与假手术组相比,VCI模型组海马CA1区神经元胞膜不规则,有不同程度的水肿,细胞器数量明显减少,线粒体变少、严重者有空泡化现象,粗面内质网脱颗粒,细胞核固缩,染色质分布不均匀。经氯化锂干预后,海马CA1区神经元超微结构得到明显改善。4 Western blot结果4.1 VCI小鼠海马自噬相关蛋白动态表达反复脑缺血再灌注损伤后小鼠海马自噬相关蛋白表达较假手术组明显增高。P-m TOR、Beclin1蛋白表达与LC3-II/LC3-I比值于1d开始升高,14d达到高峰,并持续到本实验观察到的28d(P0.01)。4.2氯化锂对VCI小鼠海马自噬相关蛋白表达的影响同假手术组小鼠相比,VCI模型组小鼠海马组织p-m TOR蛋白表达轻微升高(P0.01);经氯化锂干预后,p-m TOR蛋白表达水平明显升高,与VCI模型组相比具有统计学差异(P0.01)。经氯化锂干预后Beclin1蛋白表达与LC3-II/LC3-I比值较VCI模型组明显降低(P0.01)。结论:本实验通过反复脑缺血再灌注方法成功建立VCI小鼠模型,可用来评价氯化锂对于空间认知损害是否有效。经氯化锂干预后可明显改善小鼠空间学习记忆能力,通过上调p-m TOR表达而抑制自噬,减少海马CA1区神经元丢失,明显改善海马CA1区神经元超微结构损害。调节海马自噬相关蛋白的表达可能是氯化锂脑保护、改善空间认知功能的机制之一。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.13

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3 范鸣s，

本文编号：1214539