硒酵母对AD小鼠脑内自噬及其对Aβ、Tau清除作用的影响
本文关键词：硒酵母对AD小鼠脑内自噬及其对Aβ、Tau清除作用的影响
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【摘要】：目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种多发病于老年期的神经退行性疾病。大脑中的淀粉样蛋白Aβ形成的斑块沉积(SP)和过度磷酸化Tau蛋白聚集形成神经纤维缠结(NFTs)被公认为是AD的主要病理特征。目前认为Aβ和Tau等病理蛋白在脑内蓄积,得不到有效清除可能是造成AD的诱因之一。自噬能降解胞内变性蛋白及受损细胞器,从而维持细胞内环境稳定,它是清除Aβ和过度磷酸化的Tau蛋白的主要途径之一,而自噬通路障碍也被认为是引发AD的主要原因之一。因此对自噬过程的调控可能会为AD的治疗提供新的靶点和方向。硒酵母是富含有机硒的酵母,其内硒元素有70%以硒代蛋氨酸(Se-Met)的形式存在。本实验采用三转基因(Psen1、APPSwe、tauP301L)(3×Tg)AD小鼠从体内探索硒酵母对AD的治疗效应及通过调控自噬对Aβ、Tau等蛋白的清除作用;同时采用3×Tg原代神经元和N2a-APP695-SW细胞体外实验探究Se-Met对AD的治疗效应及自噬调控机制,为特异性治疗AD的药物研究提供科学依据。方法:1)体内实验:硒酵母以5.18g/Kg浓度加入4月龄的3×Tg AD小鼠饲料中,持续给药四个月后,采用Morris水迷宫和电跳台实验检测AD小鼠认知功能;原子荧光法检测小鼠脑内及内脏器官硒含量;特异性试剂盒检测脑内氧化应激水平(SOD)、脂质过氧化水平(MDA)及硒酶活性(Trx R、GPx);免疫荧光和Western-blot法检测以下蛋白水平的变化:Aβ、APP、BACE-1、Tau、自噬相关蛋白(LC3、P62)、自噬通路蛋白(Akt、mTOR、p70S6K、AMPK)、组织蛋白酶D(Cat-D),并通过不连续密度梯度法分离脑组织中自噬体、自噬溶酶体及溶酶体后,检测各组份中Aβ、Tau及磷酸化tau的含量。2)体外实验:分离培养新生鼠[野生型(WT)、3×Tg]皮层原代神经元,1μmol/L Se-Met处理24h后,用免疫荧光、Western-blot检测以下几方面变化:Aβ、APP、BACE-1、Tau、LC3、P62、Akt、mTOR、p70S6K、AMPK、Cat-D;N2a-APP695-sw细胞经相同浓度的Se-Met作用24h后,检测其Aβ、APP、BACE-1、β-CTF、LC3、P62、Akt、mTOR、p70S6K、AMPK、Cat-D水平变化,并且通过荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3转染法,监测细胞内自噬流的变化。结果:1)体内实验:硒酵母给药4个月后,在水迷宫实验中,3×Tg AD小鼠逃避潜伏期比对照组整体显著下降(++p0.01);同时其24h后原平台象限停留时间和跨越平台次数较对照组均显著升高(**p0.01,*p0.05)。电跳台实验中,硒酵母组小鼠在d3训练和24h记忆中的错误次数较对照组显著下降(*p0.05),在24h记忆中其平均潜伏期也相对更长。ad小鼠脑内各部分及肝、脾、肾、血清等的硒含量较野生型小鼠均显著下降(*p0.05),补充硒酵母后其硒含量又得到了显著恢复(**p0.01,*p0.05);硒酵母治疗后,小鼠脑内app、aβ寡聚体、bace-1水平显著降低(**p0.01,*p0.05);海马区的aβ1-42及tau蛋白水平均显著降低(**p0.01,*p0.05);同时小鼠海马及皮层中lc3Ⅱ水平显著性下降(**p0.01),并且海马区lc3Ⅱ与tau蛋白的共定位显著增多(*p0.05)。进一步检测自噬通路蛋白发现:ad小鼠海马和皮层区akt、mtor、p70s6k及p-p70s6k都显著升高(**p0.01,*p0.05),而ampk及p-ampk显著性下降(**p0.01,*p0.05);自噬降解底物接头分子p62水平显著下降(**p0.01),而cat-d水平显著性升高(*p0.05)。分析各自噬体组分发现:tg组小鼠的自噬体中aβ、tau、tau-ps202、tau-ps422表达水平较wt组明显增高,而硒酵母组中这些病理蛋白水平明显下降;在自噬溶酶体中,tg组中这些病理蛋白水平较wt组是下降的,而硒酵母作用后水平明显升高。试剂盒检测发现通过硒酵母治疗后,ad小鼠脑组织各部分中sod水平有升高趋势,而丙二醛含量显著下降(**p0.01,*p0.05),trxr、gpx活性显著性上升(**p0.01,*p0.05)。2)体外实验:与wt原代神经元相比,3×tg原代神经元的app、aβ、bace-1蛋白水平均显著性升高(##p0.01,###p0.001),而se-met作用后以上蛋白表达水平均显著性下降(**p0.01,*p0.05,***p0.001)。自噬方面:3×tg原代神经元较wt组lc3Ⅱ蛋白水平显著上升(#p0.05),se-met作用后,lc3Ⅱ水平显著下降(**p0.01),同时自噬体与tau蛋白的共定位明显增多;se-met组较对照组其akt及其磷酸化p-akt蛋白水平显著上升,而mtor、p70s6k及p-p70s6k水平均显著下降(**p0.01,*p0.05);同时,p62水平显著下降(*p0.05),cat-d水平显著增高(*p0.05)。se-met作用后,n2a-app695-sw细胞内aβ、app、bace-1、β-ctf水平均降低(**p0.01,*p0.05);lc3Ⅱ表达水平也显著降低(*p0.05),自噬通路蛋白中:akt、mtor、p70s6k及p-p70s6k水平均显著上升(**p0.01,*p0.05);p62、beclin1水平显著下降(*p0.05);cat-d水平显著上升(**p0.01);se-met作用也促进了细胞内lc3与aβ共定位。mtagrfp-mwasabi-lc3转染后,发现se-met能促进自噬体向自噬溶酶体的转换。结论:综上所述表明,硒酵母可以显著性提高ad小鼠的记忆能力,降低脑内app、aβ及tau蛋白水平,提高硒含量及硒酶活性,并加强脑内抗氧化能力,体内体外实验都证明硒代蛋氨酸或硒酵母一方面可以通过抑制APP和/或BACE-1水平,从而减少Aβ的生成。另一方面通过调节自噬信号通路,调控自噬水平,并促进自噬体向自噬溶酶体的转化,加强对Aβ、Tau等病理蛋白的清除。因此,硒酵母是一种在预防及治疗AD方面很有潜力的药物。
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
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