α-干扰素对神经细胞中p11、5-HTR1b和5-HTR4表达的影响

发布时间：2017-11-25 11:29

  本文关键词：α-干扰素对神经细胞中p11、5-HTR1b和5-HTR4表达的影响

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【摘要】：背景抑郁症是应用α-干扰素的一种重要副作用,但α-干扰素诱导抑郁症的分子机制还不清楚。一些研究表明5-HTR1b(5-羟色胺受体1b)和5-HTR4(5-羟色胺受体4)在p11(S100钙结合蛋白A10,S100A10)相关抗抑郁效应中发挥着重要作用,而且我们的前期研究发现α-干扰素能够下调p11水平。所以我们猜想α-干扰素诱导的抑郁可能是由p11和5-羟色胺受体介导的。为了发现这些分子在α-干扰素诱导抑郁中的功能,我们研究了α-干扰素(IFN-α)对人类神经母细胞瘤细胞(SH-sy5y)中5-HTR1b和5-HTR4表达的影响。结果发现对Balb/c小鼠腹腔注射IFN-α能够延长小鼠悬尾实验和强迫游泳实验的不动时间。IFN-α处理能够显著下调SH-sy5y细胞中5-HTR1b和5-HTR4的蛋白水平,而且这种改变呈现出时间和剂量依赖。通过过表达和沉默实验,我们揭示了5-HTR1b和5-HTR4是p11的下游效应蛋白。过表达p11有效逆转了IFN-α对5-HTR1b和5-HTR4的下调作用。这些结果表明IFN-α能够下调p11,进而下调5-HTR1b和5-HTR4。p11被认为是5-HTR1b和5-HTR4的一个有效调控因子,因此,p11可能作为IFN-α诱导抑郁症风险评估和疗效监测的一个潜在靶标。目的通过细胞实验和小鼠行为实验,研究IFN-α对p11、5-HTR1b和5-HTR4表达的影响,以及p11对5-HTR1b、5-HTR4表达的影响,从而阐述5-HTR1b、5-HTR4和p11参与IFN-α诱导抑郁的机制。方法1.动物和药物作用:实验用小鼠是成年雄性野生型Balb/c鼠。连续十天注射hIFN-α-2b(1000 IU/g/天,腹腔注射,总体积0.2 m L),对照组小鼠是腹腔注射同等体积的PBS。小鼠注射时间是每天上午九点。2.小鼠行为实验:把小鼠逐个轻柔放入一个玻璃缸中(高30cm,直径10cm),玻璃缸中盛有温度为24-26℃的水,水深18 cm,游泳6分钟。累计第2-6分钟内的不动时间以分析行为。通过远端尾部(1-1.5 cm)将小鼠悬挂在一个平坦的金属表面上,使其悬挂点距离地面40cm。记录第2-6min的不动时间,作为抑郁样行为的一个指标。3.细胞培养:人神经母瘤细胞系培养在含有10%胎牛血清的DMEM中,并含有50 U/m L青霉素,50 mg/m L链霉素,37°C,含有5%CO2。所有实验都是在细胞融合率达到80%-90%时进行的。4.hIFN-a-2b处理:细胞剂量依赖实验,用一系列浓度(0,50,500,1000,2000,and3000 IU/m L)的hIFN-α-2b处理。细胞时间依赖实验,作用时间依次为0,6,12,24,36,和48小时,用单一浓度即1000 IU/m L的hIFN-α-2b处理。5.质粒构建:构建过表达p11的质粒p11 c DNA 3.0和使p11沉默的质粒p11-Si RNA。6.质粒转染:用转染试剂脂质体2000(Invitrogen,USA)转染质粒。转染的质粒包括p11-pc DNA3.0,pc DNA3.0(对照),p11-Si RNA,and Si RNA-control(对照)。在转染后的第5小时,用PBS清洗细胞,然后继续用完全DMEM培养。7.胞膜(cytomembrane)蛋白抽提:用Mem-PER真核生物膜蛋白提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific,美国)。用抗管蛋白(Tublin)抗体(Abcam,USA)检测胞膜蛋白的纯净度。8.Western blot:Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测p11、5-HTR1b、5-HTR4的蛋白水平9.RNA抽提:用RNA提取试剂盒(Minico,USA)提取总RNA。10.RT-PCR.使用SuperscriptⅢ逆转录试剂盒(Invitrogen,USA).通过RT-PCR检测c DNA。11.统计分析所有实验非参数未配对T检验的P值都是由Prism软件计算的(Graph Pad Software Inc.)。。F检验用来比较差异。我们认为P值0.05具有显著性:*,P0.05;**,P0.01。结果1.应用IFN-α使小鼠悬尾实验和强迫游泳实验的不动时间延长。2.IFN-α能够显著下调SH-sy5y细胞中5-HT1Rb、5-HTR4的蛋白水平,且呈时间和剂量依赖。3.IFN-α能够下调SH-sy5y细胞胞膜上p11、5-HTR1b和5-HTR4的蛋白水平。4.过表达p11有效逆转了IFN-α引起的5-HTR1b和5-HTR4下调。结论p11通过影响5-HTR1b/4的蛋白水平参与α-干扰素诱导的精神抑郁。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.4

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本文编号：1225895