糖原合成酶激酶-3β在阿尔茨海默病及2型糖尿病发病中的作用

发布时间：2017-11-26 15:07

  本文关键词：糖原合成酶激酶-3β在阿尔茨海默病及2型糖尿病发病中的作用

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【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以渐进性认知功能障碍和记忆能力损害为主要表现,与年龄密切相关的常见中枢神经系统退行性疾病。2型糖尿病(Type2diabetes mellitus,T2DM)是一组以高血糖和高胰岛素血症为主要特征,与胰岛素抵抗相关的常见内分泌代谢性疾病。研究证实,T2DM是AD的独立危险因素,而AD被称为“3型糖尿病”。随着我国人口老龄化进程的加剧,T2DM及糖尿病相关AD的发病率将会迅速增长,T2DM和AD已经成为中国社会面临的严峻人口健康问题。 AD主要病理学特征是神经细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积所导致的老年斑(Senile plaques,SP)和神经细胞内tau蛋白过度磷酸化所导致的神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)。T2DM和AD存在很多的共同特征,如年龄相关病程,高胆固醇水平,能量代谢障碍,Aβ蛋白沉积,tau蛋白磷酸化,糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)蛋白活性增高,胰岛素抵抗以及氧化应激反应等。在AD病理情况下,tau蛋白过度磷酸化与蛋白激酶(Protein kinases,PK)和蛋白磷酸酯酶(Protein phosphatases,PP)的调节失衡密切相关,其中最重要的激酶是GSK-3p和酯酶是蛋白磷酸酯酶2A(Protein phosphatase2A,PP2A)。大量的研究事实表明,GSK-3β是T2DM和AD的共同激酶,一个在外周组织激活,一个在脑组织激活,但GSK-3β蛋白在T2DM并发AD中的作用及其上下游机制尚未阐明。 镁离子是人体必需的矿物质元素之一,参与了细胞多种重要的代谢活动,如糖酵解、氧化磷酸化、细胞呼吸、蛋白质合成等生理过程。已有研究表明,很多T2DM患者均存在低镁血症,并且镁缺乏被认为是T2DM很重要的发病因素之一。大量研究证实,AD患者存在血液和脑区镁含量的明显下降。镁缺乏,特别是海马脑组织镁的降低,是AD发病的重要因素之一。饮食中镁含量降低会导致认知记忆能力的下降,而在痴呆病人饮食中增加镁的摄入则能够有效改善认知功能。因此,镁与AD和T2DM的共同病理机制密切相关。但到到目前为止,镁离子和GSK-3β蛋白活性对糖尿病相关AD的影响及其机制尚不清楚。 在动物实验中,我们重点研究了镁对散发型AD(Sporadic AD, SAD)模型大鼠认知功能和GSK-3p蛋白、磷酸化tau蛋白(p-tau)的影响及其作用机制。在临床实验中,我们主要探讨了2型糖尿病并发轻度认知功能障碍(Mild cognitive impairment, MCI)的影响因素和血小板GSK-3p活性的变化及其临床意义。主要研究结果如下： 第一部分 镁对散发型AD模型大鼠学习记忆及GSK-3p和p-tau的影响 临床研究发现,阿尔茨海默病(AD)和2型糖尿病(T2DM)患者均存在低镁血症,而增加痴呆病人饮食中镁的摄入能够有效改善认知功能。动物实验也证实,镁能调控NMDAR信号通路,减轻突触的损伤,并且能逆转老年大鼠和AD模型大鼠的认知功能障碍。细胞实验亦显示,镁离子能调控AβPP的病理过程,在细胞外高镁时,AβPP能增强α-分泌酶裂解途径,从而减少Ap的生成。因此,镁离子与AD和糖尿病的共同病理生理机制密切相关。GSK-3β在AD患者脑内激活,在T2DM患者外周组织激活,因此GSK-3β是T2DM与AD的共同激酶。但镁离子和GSK-3β蛋白活性在糖尿病相关AD中的作用及其机制尚不清楚。 [目的]阐明镁是否通过调节GSK-3β活性减轻tau蛋白过度磷酸化并改善散发型AD模型大鼠的认知障碍,同时进一步探讨调控GSK-3β活性的作用机制。 [方法]实验中采用雄性SD大鼠,侧脑室定位注射(ICV,3mg/kg) STZ方法建立SAD模型,同时给予腹腔注射硫酸镁方式进行干预。大鼠随机分成了以下6组(每组12只)：假手术组(Con)、镁对照组(100mg/kg,Mg)、侧脑室注射STZ造模组(STZ)、STZ造模+50mg/kg镁干预组(STZ+Mg50)、STZ造模+100mg/kg镁干预组(STZ+Mg100)和STZ造模+200mg/kg镁干预组(STZ+Mg200).3周后利用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力的变化；应用原子火焰法检测大鼠脑内皮层和海马的镁离子含量；采用长时程增强(Long-term potentiation,LTP)、高尔基染色(Golgi staining)以及突触相关蛋白检测分析其突触结构和功能损伤情况；使用免疫组化和免疫印迹方法检测海马GSK-3β蛋白表达、tau蛋白磷酸化水平以及磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phoshoinositide3-kinase/Protein kinase B, PI3K/Akt)通路信号分子的变化；利用免疫印迹和实时荧光定量PCR技术检测海马胰岛素(Insulin, INS) mRNA、胰岛素受体(Insulin receptor, INSR)蛋白和mRNA水平的改变。 [结果]硫酸镁腹腔注射干预可以提高脑组织皮层和海马的镁离子水平,并且能有效减轻ICV-STZ导致的大鼠认知功能障碍。100mg/kg硫酸镁干预可以抑制ICV-STZ导致的LTP下降,增加海马CA1区神经元树突棘密度和蘑菇型树突棘数量,并且能逆转大部分突触相关蛋白的下降。硫酸镁干预后,ICV-STZ大鼠海马中Thr205、 Thr231、Ser396、Ser214和Ser404位点的磷酸化水平下降,可以增强GSK-3β磷酸化Ser9位点蛋白的表达,从而抑制GSK-3β蛋白的活性。同时,硫酸镁干预能够有效抑制ICV-STZ组大鼠海马中胰岛素INS的mRNA、胰岛素受体INSR蛋白和mRNA水平的下降,并且激活了相应的PI3K/Akt信号通路。 [结论]同时给予镁干预,可以提高脑组织镁离子水平,逆转长时程增强(LTP)的损伤,维持突触结构的复杂性,并通过改善胰岛素敏感性、调节PI3K/Akt/GSK-3β信号通路减轻tau蛋白的磷酸化,从而保护ICV-STZ导致的认知功能下降。因此,早期镁治疗可能预防AD的发生和延缓AD的病理进程。 第二部分 2型糖尿病合并轻度认知功能障碍的影响因素分析及血小板GSK-3β活性变化的临床意义 阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经系统退行性疾病,目前对AD尚缺乏有效的治疗措施。AD从早期病理改变到出现临床症状的疾病进程相对较长,因此,早期发现和干预可能延缓或阻止AD的发生和发展。散发性AD约占总AD发病的99%,其起病隐匿,早期无明显临床症状,早期诊断较为困难。流行病学资料显示,T2DM是诱发和加重AD的独立危险因素,T2DM患者的轻度认知功能障碍(MCI)向AD转化率是健康者人群的3倍。目前,能够用于早期诊断或预测T2DM向AD转化的临床指标尚不清楚。嗅觉功能的改变在AD疾病早期即可出现,GSK-3p蛋白是T2DM和AD的共同激酶,载脂蛋白Eε4(Apolipoprotein E ε4, ApoE ε4)是AD的一个主要遗传风险因子。因此,本论文对T2DM患者认知功能障碍与嗅觉功能、GSK-3p蛋白活性和ApoE基因多态性之间的关系进行了研究和分析。 [目的]探讨T2DM并发MCI的影响因素,并重点评估其血小板GSK-3β活性的变化及其临床意义。 [方法]研究对象为206例T2DM患者,共分为2组：2型糖尿病无轻度认知功能障碍组(T2DM-nMCI)137例,2型糖尿病合并轻度认知功能障碍组(T2DM-MCI)69例。所有被试均完成了神经心理学测试(简易智能状态检查量表、临床痴呆量表等)和嗅觉阈值评定(改良康涅狄格州化学感觉临床研究中心CCCRC法)。次日晨起抽血行常规指标检查,包括空腹血糖、餐后血糖、血清胰岛素、糖化血红蛋白(Hemoglobin Alc, HbAlc)和血镁等。利用酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法检测部分病例的血浆晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products, AGEs)、GSK-3β水平,采用免疫印迹(Western blot)和酶活性试剂盒测定部分病例血小板GSK-3β酶活性。应用蛋白斑点杂交(Dot blot)方法测定所有病例血小板总GSK-3β和Ser9-GSK-3β蛋白的表达水平,并以Ser9-GSK-3β和GSK-3β比值反映GSK-3β的活性。所有病例利用白细胞提取DNA,采用扩增抗拒突变系统(Amplification refractory mutation system,ARMS)进行ApoE基因多态性的检测和分析。 [结果]2型糖尿病合并轻度认知功能障碍组(T2DM-MCI)的MMSE评分、嗅觉阈值评分低于2型糖尿病无轻度认知功能障碍组(T2DM-nMCI),但其糖化血红蛋白高于T2DM-nMCI组。T2DM-MCI组ε4比例要高于T2DM-nMCI组,而ε3型要低于T2DM-nMCI组。T2DM-MCI组血浆AGEs、GSK-3β水平均高于T2DM-nMCI组。T2DM-MCI组血小板Ser9-GSK-3β/GSK-3p比值较T2DM-nMCI组下降,GSK-3p蛋白的活性增高。ApoE ε4基因、嗅觉功能阈值评分和Ser9-GSK-3p/GSK-3p比值与T2DM轻度认知功能障碍有统计学关联,其指标的OR值(95%CI)分别为2.72(1.19-6.18)、0.51(0.38-0.69)和0.40(0.18-0.91)。ROC曲线分析结果显示,联合指标的特异度、敏感度高于单一指标。 [结论]ApoE ε4基因、嗅觉阈值评分和Ser9-GSK-3p/GSK-3p比值是T2DM合并MCI独立的影响因素。血小板GSK-3β活性可作为T2DM合并MCI的早期诊断指标,而联合指标检测可以提高MCI诊断的特异性和敏感性。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16;R587.1

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