锌指蛋白ZFX在胶质瘤和非小细胞肺癌中的功能以及PLCH1在小鼠焦虑和恐惧记忆中的功能研究

发布时间：2017-11-29 05:06

  本文关键词：锌指蛋白ZFX在胶质瘤和非小细胞肺癌中的功能以及PLCH1在小鼠焦虑和恐惧记忆中的功能研究

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【摘要】：X染色体连锁的锌指蛋白(zinc finger protein, X-linked,ZFX)是ZFX/ZFY (zinc finger protein, Y-linked, ZFY)蛋白家族的成员。哺乳动物一般都有Zfx和Zfy基因,分别位于X、Y染色体的末端,但并不位于同源区域。ZFX和ZFY与性别选择、精子形成和特纳综合症有关。全长型ZFX蛋白包括一个转录激活区域,一个核定位序列和一个具有13个C2H2[Cys(2)His(2)]型锌指结构的DNA结合区。C2H2锌指结构是哺乳动物细胞中具有重要生理功能的常见的蛋白质结构之一。ZFX与哺乳动物胚胎期及成年体内干细胞的自我更新有关。小鼠胚胎干细胞上的研究表明ZFX和MYC以及CNOT3、TRIM28形成一个基因表达调控系统,受此调控的基因广泛涉及细胞周期、细胞死亡及癌症,因此ZFX在癌症方面的功能成为了近期研究热点。胶质瘤是一种发生于脑或脊髓的肿瘤,最常发生部位为脑,因其细胞形态和胶质细胞相似而被称为胶质瘤。胶质瘤占脑和中枢神经系统肿瘤的30%、占脑恶性脑肿瘤的80%,是人类健康的严重威胁。胶质瘤难根治、易复发,目前胶质瘤仍是医学界的一个难题。寻找新的治疗方法和药物追在眉睫,这正是我们研究ZFX在胶质瘤中功能的出发点。我们利用慢病毒介导的RNA干扰技术敲低ZFX研究它在胶质瘤中的功能。MTT分析和克隆形成分析结果表明敲低ZFX有效抑制了胶质瘤细胞系U87和U373的增殖及单细胞形成克隆的能力。用流式细胞法和衰老相关的p半乳糖苷酶染色法进一步探究发现敲低ZFX是通过把细胞周期阻滞在G0/G 1期、诱导细胞凋亡以及促进衰老等方面抑制胶质瘤。相关信号通路的蛋白水平Western blot检测表明敲低ZFX能影响Akt和MAPK/ERK信号通路。我们还建立了裸鼠皮下瘤和原位瘤模型,结果表明敲低ZFX后的胶质瘤细胞系U87在裸鼠上形成的皮下瘤和原位瘤的肿瘤体积都远小于对照组。我们的研究结果表明ZFX在胶质瘤中起到促进肿瘤增殖的作用。肺癌是导致人类死亡数较多的癌症之一。由于ZFX在肺癌组织中有调节淋巴结转移的功能,因此我们提出ZFX可能在肺癌中同样起着重要功能的假设。我们用RNA干扰技术敲低ZFX研究它在非小细胞肺癌中的功能。研究结果表明敲低ZFX后抑制了非小细胞肺癌细胞系H1299的增殖和单个细胞形成克隆的能力。进一步探究发现敲低ZFX主要通过影响迁移、引起细胞衰老、轻度增加细胞凋亡、阻滞细胞周期在G0/G1期等方面抑制H1299的生长。蛋白含量检测结果表明敲低ZFX改变了一些细胞周期、凋亡以及Akt、MAPK/ERK信号通路相关分子的蛋白表达水平,与抑制生长的现象相符。我们建立了H1299细胞系的裸鼠皮下瘤模型,结果表明敲低ZFX的干扰组的肿瘤发生率比对照组低、干扰组的肿瘤出现时间比对照组晚、肿瘤体积中位数也小于对照组。综上所述,我们的研究发现ZFX在胶质瘤和肺癌中都有促进肿瘤细胞增殖的作用,表明ZFX是一个潜在的治疗胶质瘤和肺癌特别是非小细胞肺癌的靶分子。磷脂酶C (phospholipase C,PLC)可以催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)水解为1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)和甘油二酯(diacylglycerol,DAG)。DAG和IP3是细胞中重要的第二信使,因此PLC被认为是许多重要信号通路的中枢,通过整合各种输入的信号,调控PIP2、DAG和IP3的水平。PLC家族有13个成员,PLCH1是新鉴定的该家族蛋白,又称为PLCη1。虽然PLCH1在脑内高表达,但其在脑内的功能目前还没有相关的研究。鉴于磷脂酶家族的其他成员在脑的高级功能如学习、记忆和情绪调控中发挥重要作用,因此我们利用PLCH1基因敲除小鼠来研究PLCH1在记忆和焦虑方面的作用。我们首先检测了敲除PLCH1对小鼠基本的运动协调能力的影响。开放场实验的总活动距离表明小鼠在平整地面的运动没有显著受到影响。转棒测试结果表明鼠的运动协调能力有轻微的下降。在开放场测试中,敲除PLCH1的小鼠表现出更加焦虑的表型,表现在中央区活动时间、运动距离及穿过中央区次数与野生型小鼠相比明显减少。为了进一步检测敲除PLCH1对焦虑的影响,我们采用了高台十字迷宫测试。高台十字迷宫结果显示PLCH1敲除小鼠在高台开放臂的时间,在开放臂移动的距离等都比野生型小鼠少,虽然一些参数统计起来没有显著差异,但趋势和开放场实验的焦虑倾向一致。此外我们还检测了敲除PLCH1对小鼠恐惧记忆的影响。在恐惧训练后半小时及10天后,敲除PLCH1的小鼠表现出对恐惧更强的记忆力,在实验箱中僵直的时间比例明显偏高。我们也用水迷宫检测了敲除PLCH1对小鼠空间记忆的影响。经过7天的空间记忆训练后移除逃生平台进行检测,结果表明PLCH1敲除鼠首次到达平台的时间平均值高于野生型小鼠,表明空间记忆有受损的倾向,但经单因素方差分析统计无显著差异。综上所述敲除PLCH1后,小鼠的基本运动能力没有显著改变,运动协调能力有轻微下降,对伤害后短期和长期的恐惧的记忆更强,有焦虑的倾向。综上所述,我们的初步研究结果表明：PLCH1的敲除增加了小鼠的焦虑水平,这与PLCβ1的敲除降低了小鼠的焦虑水平正好相反。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R734.2;R749;R739.4

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本文编号：1236269