1.妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为的机制研究 2.雌激素缺乏所致抑郁样和焦虑样行为的机制研究

发布时间：2017-12-07 23:06

  本文关键词：1.妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为的机制研究 2.雌激素缺乏所致抑郁样和焦虑样行为的机制研究

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【摘要】：抑郁症是一种常见的慢性精神系统疾病,其发病机制非常复杂,至今尚未完全阐明。随着成人疾病胎儿起源学说的提出,越来越多的研究证实,很多精神系统疾病的病因可以追溯至胎儿期。胎儿期母体所受各种不良环境应激,可以导致胎儿体内糖皮质激素(GCs)水平升高。而过早、过量的GCs暴露能够编程并改变脑内某些关键基因的表达,增加其成年后罹患抑郁症、焦虑等精神系统疾病风险。此外,临床上对于具有早产风险的孕妇都会给予人工合成的糖皮质激素——地塞米松(DEX),以促进胎儿肺成熟、降低呼吸窘迫综合征发生率和早产儿死亡率。然而,流行病学调查研究发现,妊娠后期暴露过量人工合成的GCs,其子代成年后罹患精神系统疾病、情感障碍等问题的风险大大增加。而妊娠后期暴露过量GCs对子代抑郁样行为具有怎样的影响?这种影响能否跨代传递?其机制又是如何?目前并不十分清楚。因此,本课题的第一部分,我们首先构建了妊娠后期暴露过量GCs大鼠模型,待其子代成年后运用糖水消耗实验、强迫游泳实验、悬尾实验和旷场实验检测其行为改变情况。行为学测试结束后将部分成年F1代两两交叉繁殖成F2代,待其成年后再次检测行为改变情况。与此同时,运用高通量全基因组表达谱芯片筛选出模型大鼠脑内抑郁关键分子,并运用分子生物学实验技术探究妊娠后期暴露过量GCs对子代脑区关键分子表达调控及抑郁样行为跨代传递的机制。临床研究证实,妇女体内雌激素急剧下降的月经期和围绝经期,其情绪紊乱如焦虑、抑郁状态迅速增加。同时,绝经期妇女抑郁评分与血浆雌二醇水平呈显著负相关,而给予雌激素替代治疗能够改善其情绪紊乱症状。提示,抑郁症与血清雌激素水平密切相关。目前,临床和动物实验虽已证实雌激素参与调节机体的情绪反应,但其机制仍未完全阐明。因此,在本课题的第二部分,我们通过去卵巢手术构建雌激素缺乏动物模型,借此观察雌激素缺乏对动物抑郁样行为的影响。然后通过雌激素、不同类型雌激素受体激动剂和炎性小体抑制剂替代治疗,观察其对去卵巢小鼠抑郁样和焦虑样行为的影响。在此基础上,运用分子生物学方法研究雌激素抗抑郁、抗焦虑效应的分子机制。主要实验结果如下:第一部分妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为的机制研究一、妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为及其跨代传递首先,构建妊娠后期暴露过量GCs子代大鼠模型。F0代SD孕鼠妊娠GD14-GD21天,腹部皮下注射0.1mg/kg DEX,对照组(Con)注射等量的生理盐水。每天一次,直至分娩。F1代大鼠成年时(9周龄),运用糖水消耗实验、强迫游泳实验、悬尾实验和旷场实验检测其行为改变情况。行为学实验结束后,将部分成年F1代两两交叉繁殖成F2代,待其成年后再次检测其行为改变情况。(一)妊娠后期暴露过量糖皮质激素导致成年F1代抑郁样行为增加F1代大鼠行为学实验结果显示:与Con组相比,DEX组大鼠糖水消耗百分比降低,强迫游泳和悬尾实验中不动时间增加,旷场实验中中央活动路程和穿梭次数减少,且无性别差异。表明,妊娠后期暴露过量GCs导致成年F1代大鼠抑郁样行为增加。(二)妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为的跨代传递F2代大鼠行为学实验结果显示:与Con♂/Con♀组相比,Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀组大鼠表现出明显的抑郁样行为,如糖水消耗百分比降低,悬尾实验中不动时间增加,旷场实验中中央活动路程和穿梭次数减少。DEX♂/Con♀组大鼠糖水消耗百分比降低,但在悬尾实验和旷场实验中其行为均未发生明显改变。以上行为学实验结果表明,妊娠后期暴露过量糖皮质激素F1代大鼠抑郁样行为主要通过母亲传递到F2代。二、妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为及其跨代传递的机制(一)妊娠后期暴露过量糖皮质激素F1代大鼠海马CRH、CRHR1表达增加1.全基因组表达谱芯片筛选海马脑区差异表达基因全基因组表达谱分析结果显示:雄性F1代Con组、DEX组大鼠海马与脑功能相关基因CRH、5-HT1A、Olr840、Olr232、Aldh1a2和Ubd的表达均发生明显改变。Real-time PCR结果表明:DEX组大鼠海马CRH m RNA表达较Con组明显增加,且无性别差异。而Aldhla2、Olr840、Olr232和Ubd m RNA表达存在明显的性别差异,这一结果与F1代DEX组大鼠抑郁样行为无明显性别差异相矛盾。提示,Aldhla2、Olr840、Olr232和Ubd不是妊娠后期暴露过量GCs所致子代抑郁样行为的关键基因。2.妊娠后期暴露过量糖皮质激素子代海马CRH、CRHR1表达增加Real-time PCR和Western blot结果显示:成年和E18天F1代DEX组大鼠海马CRH、CRHR1 m RNA和蛋白表达较Con组明显升高且无性别差异,而CRHR2 m RNA和蛋白表达均无明显改变。提示,海马CRH、CRHR1参与妊娠后期暴露过量GCs所致子代抑郁样行为增加。(二)海马CRHR1高表达导致大鼠抑郁样行为增加1.CRHR1特异性拮抗剂CP154526能够改善妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代大鼠的抑郁样行为F1代DEX组大鼠出生后第2天起,每天一次皮下注射CRHR1特异性拮抗剂CP154526,对照组注射等量的生理盐水,连续给药7天,待其成年后观察抑郁样行为。结果发现:与Con组相比,注射CP154526后DEX组大鼠抑郁样行为明显改善且无性别差异。如糖水消耗百分比增加,强迫游泳和悬尾实验中不动时间减少,旷场实验中中央活动路程增加。2.海马CRHR1过表达大鼠抑郁样行为增加正常雄性SD大鼠海马注射CRHR1过表达慢病毒载体,4周后分别运用Western blot方法检测海马CRHR1表达和行为学实验方法检测其抑郁样行为。结果显示:海马注射过表达CRHR1慢病毒4周后,CRHR1表达明显增加。同时,糖水消耗百分比降低,悬尾实验中不动时间增加,旷场实验中中央活动路程和穿梭次数减少。提示,海马CRHR1过表达能够导致动物表现出明显的抑郁样行为。(三)F1代海马CRHR1高表达能够通过母亲传递到F2代Real-time PCR和Western blot方法分别检测F2代E18和成年时海马CRH、CRHR1表达。结果显示:F2代Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀组大鼠海马CRH和CRHR1表达增加,而CRHR2表达并未发生明显改变。以上实验结果提示,F1代海马CRH和CRHR1高表达可以通过母亲传递到F2代。(四)妊娠后期暴露过量糖皮质激素子代大鼠海马CRHR1高表达及其跨代传递的机制1.妊娠后期暴露过量糖皮质激素F1代大鼠海马CRHR1启动子区特异Cp G位点甲基化水平降低F1代海马整体甲基化检测结果表明,DEX组大鼠海马整体甲基化水平较Con组明显降低。BSP法分析F1代雄性大鼠海马CRH、CRHR1启动子区Cp G岛内胞嘧啶甲基化水平的结果显示:与Con组相比,DEX组大鼠海马CRHR1启动子区-833和+13 Cp G位点甲基化水平明显降低,而CRH启动子区所有Cp G位点的甲基化水平无明显改变。提示,妊娠后期暴露过量GCs所致子代海马CRHR1表达增加可能是由于其启动子区Cp G位点低甲基化造成的,而CRH表达增加不受甲基化方式调控。2.F1代CRHR1启动子区低甲基化可以通过母亲传递到F2代F2代海马脑区整体甲基化水平检测结果表明:与Con♂/Con♀组相比,Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀组大鼠海马整体甲基化水平明显降低,而雌性F2代DEX♂/Con♀组大鼠海马整体甲基化水平明显升高。进一步,用BSP法对F2代CRHR1启动子区进行分析发现,Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀组大鼠海马-732、-671、-527-128、-76和-10 Cp G位点甲基化水平明显降低。以上结果提示,F1代CRHR1启动子区低甲基化可以通过母亲传递到F2代。3.DEX通过抑制海马脑片DNA甲基化上调CRHR1表达Real-time PCR和Western blot结果显示:DEX能够剂量依耐性上调海马脑片CRH、CRHR1的表达,而对CRHR2 m RNA表达无显著影响。同时,DEX能够降低海马脑片整体甲基化水平。甲基化转移酶激动剂3ABA能够显著降低CRHR1 m RNA表达并能逆转DEX上调海马脑片CRHR1的作用,但对CRH的表达无显著影响。以上结果表明,DEX上调CRHR1表达确实是由于海马基因组低甲基化引起的。生物信息学分析CRHR1启动子区Cp G位点结果显示:+13 Cp G位点可能是热休克蛋白HSP的结合位点。为了验证该位点甲基化对基因转录的影响,我们分别构建含有该位点和突变该位点的荧光素酶报告基因分别转染海马神经元细胞系——HT22细胞系。结果显示:与转染野生型质粒后的荧光素酶活力相比,转染突变型质粒后其荧光素酶活力降低约70%。以上实验结果表明,CRHR1启动子区+13 Cp G位点低甲基化是导致妊娠后期暴露过量GCs所致海马CRHR1表达增加的重要机制。4.F1代DEX组大鼠血清皮质酮增加的跨代传递可导致海马低甲基化F1代、F2代血清皮质酮检测结果表明:与对照组相比,F1代DEX组、F2代Con♂/DEX♀和DEX♂/DEX♀组E18时血清皮质酮显著升高。这一结果提示,妊娠后期暴露过量GCs子代大鼠高浓度血清皮质酮的跨代传递是通过母亲传递的。海马脑片培养结果表明:皮质酮能够剂量依耐性上调海马CRH和CRHR1的表达,而对CRHR2m RNA表达无显著影响。同时,皮质酮可以显著降低海马脑片整体甲基化水平。提示,妊娠后期暴露过量GCs子代大鼠海马CRHR1启动子区低甲基化跨代传递与血液皮质酮水平升高有关。(五)F2代大鼠血清皮质酮水平升高的机制1.F1代DEX组大鼠HPA轴过度激活血清皮质酮检测结果表明:雌性F1代DEX组大鼠无论与雄性Con组、DEX组交配,其妊娠第18天时血清皮质酮较对照组显著升高,且在整个妊娠过程中持续保持高浓度。Real-time PCR和Western blot结果表明:F1代DEX组大鼠下丘脑CRH m RNA和蛋白表达显著增加,海马GR m RNA和蛋白表达显著降低。以上实验结果表明:F1代血清高浓度皮质酮损伤海马脑区和HPA轴负反馈,从而使HPA轴过度激活,导致雌性F1代妊娠期间持续保持高浓度的血清皮质酮水平。2.雌性F1代妊娠时胎盘11β-HSD1表达增加分别运用Real-time PCR和Western blot方法检测F2代胎盘E18时11β-HSD1、11β-HSD2的表达情况。结果发现,F2代Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀组大鼠E18时胎盘11β-HSD1 m RNA和蛋白水平显著增加,而DEX♂/Con♀组则表达降低。而各组胎盘11β-HSD2 m RNA和蛋白表达无显著差异。第二部分雌激素缺乏所致抑郁样和焦虑样行为的机制研究(一)ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠抑郁样和焦虑样行为首先,构建OVX小鼠模型。OVX手术一周后,将OVX小鼠随机分为OVX组、OVX-E2(10μg/kg)组、OVX-E2(30μg/kg)组、OVX-PPT(10μg/kg)组、OVX-PPT(30μg/kg)组、OVX-DPN(10μg/kg)组、OVX-DPN(30μg/kg)组,每天一次腹部皮下注射0.1ml 17β-雌二醇E2、雌激素α受体激动剂PPT、雌激素β受体激动剂DPN,Sham组、OVX组注射等量的芝麻油,连续给药4周后运用糖水消耗实验、悬尾实验检测其抑郁样行为。1.ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠抑郁样行为行为学实验结果显示:与Sham组相比,OVX组小鼠糖水消耗百分比显著降低,悬尾不动时间增加。E2(10μg/kg、30μg/kg)、DPN(30μg/kg)可以增加OVX小鼠糖水消耗百分比。OVX小鼠连续给予30μg/kg E2和DPN 4周能够显著降低悬尾不动时间,而10μg/kg E2和DPN对悬尾实验不动时间无显著影响。PPT(10μg/kg、30μg/kg)对OVX小鼠的抑郁样行为均无显著影响。2.ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠焦虑样行为行为学实验结果显示:在EZM实验中,OVX组小鼠在开放臂活动时间和进入开放臂活动次数较Sham组明显减少。OVX组小鼠连续给予E2和DPN(30μg/kg)4周能够显著增加其在开放臂活动时间、进入开放臂的次数。连续给予10μg/kg E2和DPN 4周能分别增加动物在开放臂的活动时间和进入开放臂活动的次数。在OFT实验中,OVX组小鼠中央活动路程、中央活动时间和穿越次数较Sham组显著减少。OVX组小鼠连续给予E2和DPN(30μg/kg)4周能够显著增加中央活动路程、穿越次数和中央活动时间。而连续给予10μg/kg E2和DPN 4周对旷场实验相关指标均无显著影响,PPT(10μg/kg/day、30μg/kg/day)连续给药4周对上述行为学指标均无明显的改善作用。(二)ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠海马炎症反应1.OVX小鼠海马IL-1β和IL-18高表达可以被ERβ激动剂DPN所逆转ELISA结果显示:OVX组小鼠海马IL-1β、IL-18含量较Sham组显著增加,连续给予30μg/kg E2、DPN 4周,能显著降低OVX组小鼠海马IL-1β、IL-18水平,而PPT对海马IL-1β、IL-18水平无显著影响。Real-time PCR结果显示:OVX组小鼠IL-1β、IL-18m RNA表达较Sham组显著增加。连续给予30μg/kg E2、DPN 4周能够逆转OVX引起的海马IL-1β、IL-18 m RNA的高表达。Western blot结果显示:OVX小鼠海马成熟的IL-1β、IL-18含量较Sham组显著增加,同时,IL-1β、IL-18前体Pro-IL-1β、Pro-IL-18蛋白表达也较Sham组显著增加。连续给予30μg/kg E2、DPN 4周能够逆转OVX引起的海马Pro-IL-1β、Pro-IL-18、IL-1β和IL-18的高表达。此外,我们还探究了前额皮质和杏仁体IL-1β、IL-18的表达情况。结果发现OVX组小鼠前额皮质和杏仁体IL-1β、IL-18表达较Sham组无明显改变。而PPT、DPN给药4周对上述脑区IL-1β、IL-18的表达无显著影响。2.OVX小鼠海马NLRP3炎性小体激活可以被ERβ激动剂DPN所逆转Real-time PCR和Western blot结果显示:与Sham组相比,OVX组小鼠海马NLPR3m RNA和蛋白、Caspase-1 P10(激活的Caspase-1)表达显著增加,而ASC蛋白表达无显著改变。连续给予30μg/kg E2、DPN 4周能够显著降低OVX小鼠海马NLPR3 m RNA和蛋白、Caspase-1 P10蛋白表达水平,而PPT给药4周对NLPR3、Caspase-1 P10表达无显著影响。3.OVX小鼠海马TLR-2、TLR-4以及NF-κB信号通路激活可以被ERβ激动剂逆转Western blot结果显示:与Sham组相比,OVX组小鼠海马TLR-2、TLR-4及其下游的My D88蛋白表达显著增加,连续给予30μg/kg E2、DPN 4周能够显著降低OVX小鼠上述蛋白的表达。OVX组小鼠海马磷酸化的p65(p-p65)较Sham组显著增加,连续给予30μg/kg E2、DPN 4周能够显著降低OVX小鼠海马p-p65含量,而PPT(30μg/kg)给药4周对p-p65的表达无显著影响。4.OVX小鼠海马P2X7R、CD11b表达增加可以被ERβ激动剂所逆转Western blot结果显示:OVX小鼠海马P2X7R蛋白表达较Sham组显著增加,连续给予30μg/kg E2、DPN 4周能够显著降低OVX小鼠海马P2X7R的表达,而PPT(30μg/kg)对P2X7R蛋白表达无显著影响。同时,OVX小鼠海马小胶质细胞标志物CD11b的表达显著增加,连续给予30μg/kg E2Western blot结果显示:VX-765(25mg/kg、50 mg/kg)可以显著降低Sham组小鼠海马Pro-IL-18和OVX小鼠海马IL-1β、IL-18的表达。50mg/kg VX-765可以显著降低、DPN 4周能够显著降低OVX小鼠海马CD11b的表达,而PPT则无明显的改善作用。(三)VX-765可以逆转OVX小鼠抑郁样和焦虑样行为及其炎症反应1.VX-765可以逆转OVX小鼠抑郁样和焦虑样行为行为学实验结果显示:VX-765可以显著改善OVX小鼠的抑郁样行为。如连续给予50 mg/kg VX-765 4周能够显著增加OVX小鼠糖水消耗百分比,VX-765(25mg/kg、50 mg/kg)连续给药4周能显著降低OVX小鼠悬尾实验不动时间。同时,VX-765可以显著改善OVX小鼠的焦虑样行为。如连续给予25mg/kg、50mg/kg VX-765 4周增加其进入开放臂次数、时间。在旷场实验中,VX-765(50 mg/kg)可以增加其中央活动路程、穿越次数和中央活动时间。2.VX-765可以逆转OVX小鼠海马IL-1β、IL-18、p-p65和CD11b的表达Sham组小鼠海马IL-1β、IL-18和OVX小鼠海马Pro-IL-18的表达。ELISA结果显示:50mg/kg VX-765可以显著降低Sham组小鼠海马IL-1β、IL-18含量,而VX-765(25mg/kg、50 mg/kg)可以显著降低OVX小鼠海马IL-1β、IL-18含量。50mg/kg VX-765可以显著降低Sham组小鼠海马p-p65、CD11b和OVX组小鼠p-p65、CD11b的表达,而25mg/kg VX-765可以降低OVX小鼠海马CD11b的表达。结论:1.妊娠后期暴露于过量GCs能够导致F1代抑郁样行为增加,并且这种抑郁样行为可以通过母系传递到F2代。其机制可能与GCs导致F1代海马低甲基化进而引起海马CRHR1高表达有关。2.雌性F1代海马GR表达减少使HPA轴负反馈失衡导致HPA轴持续性激活,进而导致其在妊娠过程中胎盘11β-HSD1表达增加、胎儿血清皮质酮水平增加。高浓度血清皮质酮通过表观遗传学机制上调海马CRHR1的表达,后者导致F2代抑郁样行为母源性增加。3.雌激素和ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠抑郁样和焦虑样行为。其机制可能是通过抑制OVX小鼠海马NLRP3炎性小体,进而抑制海马小胶质细胞激活、降低促炎细胞因子IL-1β、IL-18表达。4.OVX能够激活TLR-2、TLR-4及其下游的My D88、NF-κB信号通路和P2X7R。NLRP3炎性小体抑制剂VX-765能够抑制海马促炎细胞因子IL-1β、IL-18表达,进而改善OVX小鼠抑郁样和焦虑样行为。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.4

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