靶向调节NLRP1炎症小体介导的神经元焦亡治疗阿尔茨海默病

发布时间：2017-12-08 01:00

  本文关键词：靶向调节NLRP1炎症小体介导的神经元焦亡治疗阿尔茨海默病

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【摘要】：目的：研究NLRP1炎症小体对β-淀粉样蛋白(Amyloid-β, Aβ)诱导的皮层神经元焦亡的作用,及其在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)发生中的机制,探讨靶向调节脑内NLRP1炎症小体对APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠认知功能和脑内神经病理的影响。方法：1、离体层面：分离纯化大鼠皮层神经元,应用不同浓度的Aβ1-42作用于神经元,测定神经元活力和乳酸脱氢酶(LDH)释放量,通过TUNEL染色阳性细胞计数,ASC荧光染色,了解神经元的焦亡情况；同时,采用免疫印迹法检测Aβ1-42作用下NLRP1表达、Caspase-1活性水平,ELISA检测IL-1β表达水平。应用小干扰RNA (siRNA)技术,了解NLRPl炎症小体信号通路在Aβ1-42诱导的神经元焦亡过程中的作用。2、活体层面：选取雄性3月、6月及9月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠以及其对照同源野生小鼠,通过免疫印迹法、荧光共定位法测定脑组织神经元中NLRPl随年龄变化的表达情况。之后选取5月龄APPswe/PS1dE9小鼠,随机分为干扰组和对照组。干扰组于第三脑室通过微型渗透泵持续输注NLRP1或Caspase-1 si RNA (0.11 μl/h)以抑制脑内NLRP1或Caspase-1的表达；对照组输注对照siRNA (0.11 μl/h)。6周后,干扰效率通过免疫印迹法以及RT-PCR法确认。通过Morris水迷宫测定小鼠空间学习记忆能力。通过免疫印迹法测定脑中Caspase-1活性水平、IL-1β表达水平的变化；通过TUNEL染色观察小鼠皮层、海马区神经元TUNEL阳性细胞百分比变化,尼氏染色观察神经元细胞浆中的尼氏小体(Nissl body)变化,免疫组化观察胞外淀粉样斑的变化。结果：1、离体层面：5 μmol/L Aβ1-42与原代培养的大鼠皮层神经元共同孵育24h诱导神经元焦亡,表现为TUNEL染色阳性细胞数增多,LDH释放量增加,ASC斑形成；同时NLRP1表达水平升高,Caspase-1激活,IL-1β释放增多。用NLRP1 siRNA对大鼠皮层神经元进行预处理48h后再加入Aβ1-42共同孵育,发现靶向抑制NLRP1对Aβ致神经元焦亡损伤有明显的保护作用,表现为TUNEL染色阳性细胞数减少,LDH释放量减低；同时活化态Caspase-1明显降低,IL-18释放减少。2、活体层面：与同月龄对照小鼠相比,6月龄和9月龄APPswe/PS1dE9小鼠脑神经元中NLRP1水平显著升高。给予NLRP1或Caspase-1 siRNA 6周能降低APPswe/PS1dE9小鼠脑内NLRP1或Caspase-1水平约50-60%。同时,干扰组小鼠脑内IL-1β水平明显降低；神经元胞浆中Nissl body改变减轻、数量增多,神经元TUNEL阳性细胞百分比减低,而胞外淀粉样斑尚未见明显变化。此外,Morris水迷宫隐蔽平台实验中,干扰组小鼠寻找平台潜伏期及游行距离较对照组明显缩短；空间探索实验中,干扰组小鼠在目标象限游泳时间较对照组明显延长。结论：NLRP1炎症小体信号通路在Aβ诱导的神经元焦亡过程中发挥重要作用。靶向抑制脑内NLRP1或Caspase-1表达可改善AD转基因小鼠空间学习记忆能力以及脑内神经元焦亡。NLRP1炎症小体有可能成为抗AD药物作用的潜在新靶点。
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16

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