GPR50通过诱导自噬途径降解BACE1分子机制的研究

发布时间：2017-12-09 05:06

  本文关键词：GPR50通过诱导自噬途径降解BACE1分子机制的研究

  更多相关文章： GPR50 BACE1 自噬 阿尔茨海默病 CREB

【摘要】：目的:研究G蛋白偶联受体家族(G protein coupled receptor,GPCR)成员GPR50促进β-分泌酶(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)降解的作用及机制,从而确定GPR50在阿尔茨海默病病理发展的作用,为治疗阿尔茨海默病寻找到新的药物靶点。方法:1)在HEK-293T细胞系上过表达BACE-HA,然后转染不同浓度的GPR50-FLAG,分析GPR50对BACE1蛋白的调控作用。2)在HEK-293T细胞系和MEF细胞系上分别加入自噬激活剂Trehalose和Rapamycin,作用不同的时间段,检测BACE1和LC3 II蛋白水平的变化;在HEK-293T细胞系上使用自噬抑制剂3-MA作用不同时间段,检测BACE1蛋白水平的变化,分析BACE1是否经自噬途径降解。3)在野生型MEF细胞和MEF ATG5 KO细胞上过表达GPR50,检测BACE1的蛋白水平变化;在CHO细胞上转染GPR50-FLAG,用自噬抑制剂3-MA处理细胞,转染48小时后利用蛋白印迹检测BACE1和FLAG的蛋白表达水平,分析GPR50是否经自噬降解BACE1。4)在HEK-293T细胞上过表达GPR50-FLAG或siRNA,利用蛋白印迹实验检测LC3-II的蛋白表达水平;在HEK-293T细胞上过表达GPR50-FLAG和LC3-GFP,使用免疫荧光染色技术对细胞进行染色,利用激光共聚焦显微镜观察GPR50对LC3形态变化的影响;从而分析GPR50对自噬的激活作用。5)在HEK-293T细胞上过表达GPR50-FLAG,检测自噬相关蛋白LC3、ATG5、ATG7、CREB、mTOR等蛋白水平的变化;取三个月大的GPR50 KO小鼠,提取脑组织蛋白,检测BACE1、ATG5、ATG7、CREB、LC3蛋白水平的变化,并且提取脑组织mRNA,通过q-PCR的检测方法来检测自噬相关基因ATG5、ATG7的mRNA表达水平;在HEK-293T细胞系上分别干扰GPR50和CREB,检测BACE1、LC3的蛋白水平变化,分析GPR50激活自噬,调控BACE1降解的分子机制。结论:1:蛋白印迹实验结果证明BACE1能够通过自噬途径降解;2:GPR50能够激活自噬以及自噬相关蛋白,并促进BACE1的降解;3:q-PCR结果显示GPR50对自噬相关基因ATG5、ATG7的mRNA水平有上调作用。总结:通过以上实验结果证明GPR50通过激活P-CREB从而激活自噬,并且促进BACE1通过自噬途径降解,从而可能为治疗阿尔茨海默病提供新的治疗靶点。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16

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本文编号：1269156