APOE和MTHFR基因多态性协同分析在阿尔茨海默病遗传易感性的研究

发布时间：2017-12-10 21:34

  本文关键词：APOE和MTHFR基因多态性协同分析在阿尔茨海默病遗传易感性的研究

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【摘要】：阿尔茨海默病(AD)是痴呆最常见的类型,是一种缓进性神经退行疾病,表现为进行性认知障碍和记忆力损害,主要的病理改变有神经炎斑块和神经纤维缠结。脑组织病理检查发现上述的病理特征是AD诊断的金标准,但一般难以实现。临床上AD的诊断主要根据患者病史、体格检查和神经心理量表等,并排除其它痴呆类型。AD的发病机制还不明确,目前有不少假说解释AD的发生发展。其中比较主流的假说有以下两种,一种认为淀粉样前蛋白(APP)经β1和Y分泌酶裂解生成的Aβ由于代谢不平衡引起累积、聚集和沉积,产生神经炎斑块影响了脑组织正常的结构和功能,最终导致AD的发生；另一种假说认为tau蛋白的过度磷酸化是AD发生的罪魁祸首。AD按照发病年龄可分为早发型和晚发型两种,一般将发生在65岁之前的AD归为早发型AD,发生在65岁之后归为晚发型AD。在大于65岁人群中,AD的发生率为5-10%,65岁以后患AD的风险每隔五年翻一番,在80-90岁人群中发生率为15%-20%。晚发型AD存在遗传易感性,最典型的遗传危险因素是载脂蛋白E(APOE)基因多态性,除了APOE基因多态性外,其它一些危险因素也可诱发AD的发生,例如高同型半胱氨酸(HCY)血症,高同型半胱氨酸血症被认为是阿尔茨海默症的另一危险因素,而5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是体内降解HCY的重要生物酶,不可逆地催化5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸,后者作为甲基供体经过蛋氨酸合成酶的催化,使HCY转化成蛋氨酸。MTHFR的活性下降直接导致HCY水平的增高,因此MTHFR基因与AD的发生间接相关。APOE基因可有三种不同的等位基因,分别为ε2、ε3和ε4,这些等位基因可根据第112位和158位核苷酸的差异组合成6种基因型：ε2ε2(112TT+158TT)、ε2ε3 (112TT+158T/C)、ε2ε4 (112T/C+158T/C)、ε3ε3 (112TT+158CC)、ε3ε4(112T/C+158CC)和ε4ε4 (112CC+158CC)。ε4等位基因是AD的易感基因,￡4￡4纯合子比杂合子更容易发生AD,且￡4基因携带者比不携带人群发生AD的时间更早,而￡2被认为是人群不忠AD的保护因子。MTHFR基因位于染色体1p36.3,编码区全长1980bp,编码蛋白的分子量为74.6kDa。cDNA序列长2.2kb,有10个内含子和11个外显子,长度为102-432bp,内含子长度为250bp-1.5kb。现已发现MTHFR基因有30余种突变类型,MTHFR基因变异导致酶活性的改变。MTHFR基因第677位核苷酸在人群中的差异最为常见,可存在三种基因型：677CC、677CT和677TT。其中677CC为野生型,677CT和677TT分别为杂合突变型和纯合突变型,基因突变后所编码的MTHFR酶活性降低且不稳定,降低了降解HCY的功能,因此可导致HCY升高。流行病学调查表明,目前全球有3500万人患痴呆症,其中超过75%为AD。发病率每20年升一倍,据估计,到2050年将有1.15亿人受AD影响。这不仅对患者和其家庭来说是一个极大的痛苦,对整个社会而言也构成巨大的经济压力。目前,AD尚缺乏有效的诊断指标,随着全球老龄化速度加快,AD已经成为社会的沉重负担。因此干预和控制危险因素,及早对高风险人群进行干预,延缓AD的发生和发展显得尤为重要。本研究针对AD的遗传因子APOE基因、由其编码的APOE、HCY以及编码降解HCY的关键酶MTHFR基因作为研究目标,探讨这些因素协同作用与AD的发生和发展的相关性。本研究分以下三个章节：第一章AD患者APOE等位基因频率与血清APOE水平的相关性目的：检测AD患者和健康对照组APOE基因多态性,分析两组人群APOE等位基因频率,同时分析所有受检者不同APOE基因型血清APOE水平的差异、相同APOE基因型的AD患者与健康对照组的血清APOE水平的差异以及AD患者与健康对照组总体血清APOE水平的差异,探讨AD患者APOE等位基因频率与血清APOE水平的相关性。方法：根据CCMD-3诊断标准入主,收集2014年7月至2015年3月广州市脑科医院住院的200例AD患者作为AD组,男85例、女115例,年龄76±10岁。同时我们招募了年龄性别组成、生活环境和受教育程度等方面与AD组无显著差异的非AD的健康老年人159例,男70例、女89例,年龄73±10岁。为了保持遗传背景的一致性,所有受检对象均选择汉族人,均未服用降脂药物。采集研究对象的清晨空腹静脉血6～8ml,其中2~3ml以EDTA抗凝,4±1℃保存,3天内提取DNA,用于APOE基因多态性检测；另外4～5ml收集于真空干燥管中,当天检测血脂。用DNA微阵列技术检测研究对象的APOE基因多态性,并随机抽取每种基因型各2例的PCR扩增产物进行DNA测序。分析APOE等位基因频率的分布及APOE各等位基因频率与APOE的相关性。结果：AD组APOE基因型分布：ε2ε3 (3.0%),ε2ε4(1.5%),ε3ε3(49.0%), ε3ε4 (43.5%),ε4ε4(3.0%):等位基因频率：ε2(2.25%),ε3(72.25%),ε4(25.5%)。对照组APOE基因型分布：ε2ε2(0.6%),ε2ε3(13.8%),ε 2ε4(1.3%),ε3ε3(69.8%),ε3ε4(14.5%):等位基因频率：ε2(8.18%),ε3(83.96%),ε4(7.86%)；AD组APOE水平为33.33±10.90mg/L,对照组为41.25±11.35mg/L。所有受检者中,ε2、ε3、ε4携带者APOE分别为50.86±6.21mg/L.38.78±12.07mg/L.30.47±7.68mg/L.结论：人群中APOE等位基因所对应的APOE水平为ε2ε3ε4,有显著差异(P≤0.05)；相同APOE基因型的AD患者与健康对照组APOE水平无显著差异(P0.05),但AD患者APOE总体水平低于健康人群,导致这种差异的主要原因可能是AD患者中APOE ε4等位基因频率显著高于健康人群所致。第二章DNA微阵列技术检测不同HCY水平人群MTHFR基因多态性目的：检测不同水平HCY患者MTHFR基因第677核苷酸的突变频率,探讨MTHFR基因多态性与HCY水平的相关性。方法：收集广州市脑科医院2015年2月至2015年9月住院的HCY异常患者(HCY15 μmol/L)作为实验组,共435例,男363例、女72例,平均年龄48.92±16.52岁,HCY平均水平为24.50±8.74μ mol几。将实验组按照HCY水平分成四组,15 μmol/LHCY≤20μmol/L为1组,20 μmol/LHCY≤25μmol/L为2组,25 μmol/LHCY≤30 μmol/L为3组,HCY30μmol/L为4组,同时收集性别、年龄和生活环境等方面与实验组无显著差异的HCY正常(HCY≤15μmol/L)的健康人群为对照组,共229例,男173例、女56例,平均年龄46.38±16.72岁,HCY平均水平为12.07±2.03μmol/L。采集各研究对象清晨空腹静脉血5-6 ml,其中3～4ml置于干燥管,立即离心分离血清,1小时内检测HCY,另1-2ml置于EDTA抗凝管,2-8℃保存,3d内提取DNA用于MTHFR基因检测。用DNA微阵列技术检测研究对象的MTHFR基因第677核苷酸的突变,统计分析各组MTHFR基因型及等位基因频率分布。结果：对照组、1组、2组、3组、4组的TT基因型分布为1.7%、2.4%、8.2%、21.2%和50.8%；T等位基因频率分别为0.207、0.212、0.306、0.403和0.670。MTHFR基因677位核苷酸由C变异为T与HCY水平显著相关(x2=180.16,P0.0001),且随着HCY水平升高T等位基因频率呈增大趋势,经线性趋势检验有统计意义(x2=156.67,P0.0001)；同时,单独1组与对照组比较,MTHFR基因型和等位基因频率分布没有显著差异(x 2=0.031,P0.05)。结论：MTHFR677位等位基因由C突变为T是导致HCY水平明显升高的重要原因,而且是HCY30μmol/L人群的主要原因；而HCY轻度升高(15μmol/L HCY≤20μmol/L)可能为其它原因所致,并非MTHFR基因突变引起。第三章APOE基因和MTHFR基因协同在AD遗传易感性中的研究目的：分析AD与APOE基因型、MTHFR基因型、APOE和HCY血清水平之间的相关性,以探讨多种因素联合在AD易感性预警中的作用。方法：用DNA微阵列技术检测200名AD患者和159名非痴呆老年人(大于50岁)的APOE和MTHFR基因型。同时分别以免疫比浊法和酶法检测研究对象血清APOE与HCY水平。以二分类logistic回归方法选择AD的预测因子,并用所获得的预测概率建立ROC曲线。结果：APOE ε4等位基因、MTHFR TT基因型、APOE与HCY血清水平显著影响AD的发病(P0.05)。ROC曲线下面积(AUC)为0.828 (P0.001), ROC模型AD易感性的判断标准为大于0.413,敏感度为77.7%,特异度为76.5%。结论：APOE ε4等位基因、低APOE血清水平和高HCY血清水平是AD的独立预测因子,MTHFR基因型是依赖APOE ε4等位基因的AD的非独立影响因子。上述因素共同影响AD的发生,可以利用这些因素作为AD易感性的联合预测因子。全文小结：1、本研究人群中APOE等位基因所对应的APOE水平为ε2ε3ε4,与大部分研究结果一致。2、AD患者与健康人若是相同APOE基因型,则APOE水平无统计学差异,若为不同APOE基因型,则APOE水平有统计学差异,且APOE水平为ε2ε3ε4。然而AD患者APOE血清水平却低于健康人群。这种差异的主要原因可能是AD患者中APOE ε4等位基因频率显著高于健康人群所引起。3、MTHFR c677位点C→T的突变是导致HCY水平明显升高的重要原因,而HCY轻度升高可能是其它原因所致,并非由MTHFR基因突变引起。4、 由logistics分析模型可知,APOEε4等位基因、低APOE血清水平和高HCY血清水平是AD的独立预测因子,MTHFR基因型是依赖APOE ε4等位基因的AD的非独立影响因子。上述因素共同影响AD的发生,可以作为AD易感性的联合预测因子。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16

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