TRIM32的缺失导致小鼠自闭症样行为的实验研究

发布时间：2017-12-21 06:13

  本文关键词：TRIM32的缺失导致小鼠自闭症样行为的实验研究　出处：《南方医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： TRIM32 自闭症 自闭症样行为 GABAergic神经元 氯硝西泮

【摘要】：自闭症(Autism),又称孤独症,是一种以严重的、广泛的社会相互影响和沟通技能损害以及刻板的行为、兴趣和活动为特征的遗传性、多样性神经系统发育障碍性疾病,目前也被广称为自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD)。患者常表现出不同程度的社交能力,语言沟通能力以及相关日常生活能力的异常,同时还伴有心理发育滞缓,智力低下,癫痫等相关症状,更有患者出现睡眠异常、多动以及注意力不集中等情况。这不仅对患者的健康、精神和生活造成极大的伤害,也给其家庭和社会带来了许多的问题和困难。目前,自闭症已成为一种全球性的难题之一,据统计,全球大约有3500万人患有自闭症,大约每150个人中就有1个自闭症患者,而急速增长的发病率,让全世界对其越发的关注,为此联合国将每年的4月2日命名为“世界自闭症关注日”,以提醒全世界提高对自闭症的关注和认识。遗憾的是,目前对于自闭症的发病原因仍不完全清楚。自闭症患者的大脑皮层、海马以及杏仁核存在着不同形式的发育异常,关键脑区神经元异常增多,导致局部区域的神经网络过度连接；早期神经系统发育过程中,神经元迁移异常,导致神经元异常定位：不同区域兴奋-抑制性神经元失衡,导致相应神经网络调节异常；神经元突触和树突棘的异常发育导致神经元之间信号传导异常等都可能与自闭症的发生发展密切相关。TRIM32 (Tripartite motif 32)是一种具有E3泛素链接酶活性的蛋白,其蛋白结构中除了具有TRIM家族特征性的锌指结构域、B-boxes结构域和卷曲结构域之外,还有其独特的6个重复性的NHL结构域。先前的大量研究表明TRIM32在肌肉系统中有着重要的作用：TRIM32能够调节骨骼肌干细胞的分化,TRIM32遗传性的缺失常常导致2H型肢带肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy type 2H (LGMD2H));在癌症领域TRIM32被广泛的报道参与了肿瘤细胞的生长和转移。此外,TRIM32在巴尔德-别德尔综合征(Bardet-Biedl syndrome(BBS))中也起着重要的作用。近年来,随着TRIM32被广泛的关注和研究,其在中枢神经系统领域的作用也逐渐被认识：TRIM32作为细胞命运的决定子,不仅能够调节胚胎神经前体细胞往神经元方向分化,也能够参与成年神经前体细胞的神经发生;而TRIM32的遗传性丢失可以导致嗅球区神经元的过量产生并最终引起嗅觉能力的损害。与此同时,许多与中枢神经系统相关的疾病也被广泛地和TRIM32联系到了一起,这其中包括：阿尔茨海默病(Alzhermer's Disease, AD)、注意力缺陷多动症(Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD)、焦虑和强迫症(Obsessive Compulsive Disorder, OCD)等,而自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD)作为一种广泛性的神经系统发育性的疾病不可避免的也被联系到了一起。本研究中我们首先揭示了TRIM32高表达于小鼠成熟的大脑皮层神经元以及胎脑的MGE区中间神经前体细胞中,然后通过在TRM32基因敲除小鼠中进行自闭症相关行为学的测试,发现TRIM32的遗传性缺失导致小鼠表现出了自闭症核心的社交障碍和重复刻板样举止。同时,γ-氨基丁酸能(GABAergic)抑制性神经元的大量减少在TRIM32敲除的小鼠大脑皮层中被发现；进一步研究表明这种减少的GABAergic抑制性神经元是由于胚胎发育过程中TRIM32的缺失导致中间神经节隆起(Medial ganglionic eminence,MGE)区的中间神经前体细胞增殖分裂减少所致,而这种增殖分裂减少的内在机制是由于TRIM32的缺失导致c-Myc和PI3K-Akt-mTOR等信号分子发生溶酶体自噬降解所致。此外,本研究还通过增强GABAergic神经元突触抑制作用的药物氯硝西泮(Clonazepam)成功地改善了TRIM32敲除小鼠的社交行为和刻板样行为障碍。第一章TRIM32基因在成年小鼠大脑皮层和胚胎小鼠MGE区表达情况的研究目的：研究成年小鼠大脑皮层和胚胎小鼠MGE区TRIM32的表达情况。方法：分别取材3个月龄和孕13.5天(E13.5)的野生小鼠的端脑,后放入4%的多聚甲醛中后固定,经30%的蔗糖脱水后进行冰冻切片。取相应组织的切片进行免疫组织化学荧光染色以揭示TRIM32在两种组织中的表达和分布情况。结果：在3月龄的小鼠大脑皮层中,TRIM32主要表达于NeuN阳性的成熟神经元中而在GFAP阳性的星形胶质细胞和Ibal阳性的小胶质细胞中却没有表达；而在孕13.5天(E13.5)的胎脑中,TRIM32在MGE区高表达于Sox2阳性的中间神经前体细胞中。结论：TRIM32在成年大脑皮层中特定表达于成熟的神经元中但不表达于星形胶质细胞和小胶质细胞中,而在胚胎时期的MGE区高表达于中间神经前体细胞中,这说明TRIM32可能参与了MGE区中间神经前体细胞神经发生方面的调控。第二章TRIM32遗传性的缺失导致了小鼠自闭症样行为目的：明确TRIM32的缺失是否可以引起小鼠自闭症样行为。方法：采用TRIM32基因敲除(TRIM32-/-)小鼠和其同窝对照的野生(TRIM32+/+)小鼠进行自闭症相关的行为学测试,包括社交行为(三室社交偏好实验(3-Chamber social preference test)、双向互动实验(Reciprocal interaction)、少年玩耍实验(Juvenil play)、筑巢实验(Nest building)和刻板样举止(Y迷宫自发性选择实验(Y-maze spontaneous alternation)、自我捋毛实验(Self-grooming))相关的实验。结果：TRIM32-/-小鼠表现出了自闭症样的行为障碍。具体表现为：在3-chambers实验中,TRIM32-/-小鼠对于在空笼子和陌生小鼠侧的停留时间(time in chamber)上没有明显的差异(p=1.00),但是在与陌生小鼠的交流时间(interaction time)上,TRIM32-/-的小鼠明显少于TRIM32+/+小鼠(p=0.016),虽然TRIM32-/-小鼠对于空笼子来说更加的偏好于和陌生老鼠交流(p=0.004)；进一步地,当另一只陌生小鼠被放入空笼子中的时,TRIM32-/-的小鼠对于两侧的小鼠无论在停留时间(p=0.396)还是交流时间(p=0.544)上都没有明显的差异。在Reciprocal interaction实验中,TRIM32-/-的小鼠虽然在互动过程中展示出的攻击性行为时间和野生小鼠没有明显的差异(p=0.113),但是表现出非攻击性行为的时间却明显的低于野生对照的小鼠(p=0.013)。同样地,我们用出生之后21天(P21)的TRIM32-/-小鼠和同窝对照的TRIM32+/+小鼠进行了Juvenil play实验,结果显示TRIM32-/-的小鼠相对于野生小鼠而言表现出更少的社交行为(Social) (p=0.024)而重复性的捋毛行为(Grooming)却明显地多于野生小鼠(p=0.033),但是在逃避性的挖掘动作(Digging)方面却没有明显的区别(p=0.883)。在反映home social行为的筑巢实验(Nest building)中,我们同样发现了TRIM32-/-的小鼠有更差的表现(p=0.003)。此外,刻板样举止的检测中,Y迷宫自发性选择实验和自我捋毛实验均显示TRIM32-/-的小鼠有更多的偏执行为和重复动作(Y-maze spontaneous alternation test:p=0.008; Self-grooming:p =0.033)。结论：TRIM32基因敲除小鼠展示出了自闭症样的行为障碍。第三章TRIM32的缺失导致大脑皮层GABAergic的抑制性中间神经元数量减少目的：探索TRIM32缺失之后小鼠大脑皮层GABAergic的抑制性中间神经元数量的变化。方法：取出生后21天大小的TRIM32-/-小鼠和其同窝对照的野生型小鼠大脑,经4%的多聚甲醛灌注后再后固定24小时,而后经30%的蔗糖脱水处理之后进行冰冻切片。切片中进行小清蛋白(Parvalbumin(PV)),钙网膜蛋白(Calretinin(CR)),神经肽Y(Neuropeptide Y(NPY)),生长抑素(Somatostain(SST))等中间神经元抗体的免疫荧光染色,并统计其在TRIM32-/-和野生小鼠大脑皮层中的数量差异。结果：在出生后21天的青年TRIM32-/-小鼠大脑皮层中,PV、CR、 NPY、 SST等蛋白阳性的中间神经元数量较其同窝对照的野生型小鼠均是明显降低的。(PV:p0.001; CR:p0.001;NPY:p0.001; SST:p=0.005).结论：TRIM32的缺失导致小鼠大脑皮层多种中间神经元数量减少。第四章胚胎MGE区中间神经前体细胞增殖的减少导致大脑皮层中间神经元数量减少目的：探索RIM32缺失之后导致大脑皮层中间神经元数量减少的原因和机制。方法：孕13.5天(E13.5)的TRIM32杂合(TRIM32+/-)小鼠,于处死前30min给予BrdU (50mg/kg)腹腔注射,后取胚胎TRIM32-/-小鼠及其同窝对照的野生小鼠端脑,经固定,脱水处理后进行冰冻切片。在切片中进行BrdU免疫组织荧光染色,并统计MGE区Brdu阳性细胞的数量差异。此外,我们还进行pH3抗体的荧光染色,并统计其在两组小鼠MGE区的数量差异。而Caspase-3抗体的染色被同样的进行,并计数。进一步地,我们通过Western-Blotting免疫印迹的方法,还对MGE区c-Myc和PI3K-Akt-mTOR等与细胞增殖密切相关的分子和信号通路,以及与自噬溶酶体蛋白降解途径激活相关的分子——微管相关蛋白轻链3(LC3)等进行了表达量的检测。.结果：免疫荧光染色BrdU后计数显示,TRIM32-/-的小鼠MGE区BrdU阳性的增殖的中间神经前体细胞数明显的少于其同窝对照的野生型小鼠(p=0.009)。同时,pH3阳性的细胞数较野生型小鼠也同样是减少的(p=0.036)。而Caspase-3阳性的凋亡细胞数,在TRIM32-/-和野生型小鼠的MGE区是没有差异的(p=0.493)。免疫印迹的结果则显示,TRIM32缺失之后MGE区的c-Myc和PI3K-Akt-mTOR信号分子表达水平明显降低(c-Myc:p0.001;p-PI3K:p=0.022; p-Akt:p=0.01;p-mTOR:p0.001),而在TRIM32缺失之后的MGE区LC3Ⅱ型的表达量明显升高(p=0.014)。结论：TRIM32的缺失导致胚胎时期MGE区增殖的中间神经前体细胞数量减少,并最终可能导致成年大脑皮层抑制性中间神经元的减少。此外,这种增殖的中间神经前体细胞的减少与细胞凋亡并不相关,很有可能是受到c-Myc和威PI3K-Akt-mTOR信号通路的抑制所导致的。而这种抑制与TRIM32缺失之后蛋白的自噬溶酶体途径被激活引起蛋白自噬降解有关。第五章氯硝西泮能够部分改善TRIM32基因敲除小鼠的自闭症样行为障碍目的：探索氯硝西泮增强GABAergic神经元抑制作用后能否改善TRIM32-/-小鼠的自闭症样行为障碍。方法：4-6月龄大的TRIM32-/-成年小鼠和其同窝对照的野生型小鼠,给予氯硝西泮(Clonazepam, CLZ) 0.025mg/kg的剂量于行为学测试前30min进行腹腔注射。对照组给予等量的0.9%生理盐水(Saline, SAL)注射。测试小鼠具体分组为：TRIM32-/-小鼠氯硝西泮注射组(TRIM32-/-CLZ); TRIM32-/-生理盐水注射组(TRIM32-/-SAL);野生型小鼠氯硝西泮注射组(TRIM32+/+CLZ);野生型小鼠生理盐水注射组(TRIM32+/+SAL)。四组小鼠均进行自闭症相关行为学的测试。包括社交行为(三室社交偏好实验(3-Chamber social preference test)、筑巢实验(Nest building)和刻板样举止(Y迷宫自发性选择实验(Y-maze spontaneous alternation)、自我捋毛实验(Self-grooming))相关的实验。结果：三室社交偏好实验中,TRIM32-/-的小鼠经CLZ注射后,在停留时间(Time in chamber)上明显的更偏向于有陌生老鼠一侧,而不是空笼子侧(p=0.001)：而在交流时间(Interaction time)上,TRIM32-/- CLZ组虽然和TRIM32-/-SAL组一样都是偏向于和陌生老鼠交流(p0.001),但是其和陌生老鼠交流的时间却明显的多于TRIM32-/- SAL组,差异有统计学意义(p0.001)。当放入另一只陌生老鼠之后,TRIM32-/- CLZ组小鼠在停留时间上和TRIM32+/+ SAL组一样,明显的偏向于熟悉老鼠一侧(p0.001),而不是和TRIM32-/- SAL组小鼠一样对于熟悉和陌生小鼠没有明显的偏好差异(p=0.100),并且在交流时间上,TRIM32-/- CLZ组小鼠更多的和陌生老鼠交流(p0.001),而不是像TRIM32-/ SAL组小鼠一样对于陌生和熟悉小鼠没有交流时间上的差异(p=0.396)。但是在反应Home-social行为的筑巢实验中,我们并没有观察到氯硝西泮能够显著提高TRIM32-/-小鼠的筑巢评分(p=0.374)。此外,在反映刻板样行为的Y迷宫自发性选择实验中,TRIM32-/- CLZ组小鼠较TRIM32-/- SAL组而言明显的减少了未改变的目标臂选择比例(p=0.042)。结论：TRIM32-/-的小鼠经CLZ注射后,能够一定程度的改善其社交和刻板样行为障碍,但对于重复行为的改善却没有明显的作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.94

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 Harrison M.J.;O'Hare A.E.;Campbell H.;张振;;苏格兰洛锡安地区自闭症发生率的研究:采用“捕获-再捕获”技术进行评估[J];世界核心医学期刊文摘(儿科学分册);2006年05期

2 Ami Klin;Warren Jones;;自闭症个体社会能力的预报器:观察自然社会情形时的目测定位模式[J];医疗保健器具;2007年09期

3 Philip Teitelbaum;Osnat Teitelbaum;;幼年的行为分析可能有助于自闭症的早期诊断[J];医疗保健器具;2007年09期

4 ;大脑活动可能影响自闭症相关基因[J];微循环学杂志;2008年03期

5 ;自闭症的可能成因[J];安徽医学;2009年01期

6 丁启文;陈曦;;尊重人的每一种生命形态——《透视自闭症》读后[J];中国残疾人;2011年06期

7 ;基因组分析证实免疫系统导致自闭症[J];生物医学工程与临床;2013年01期

8 老戚;;星星下的你[J];新民周刊;2014年14期

9 仇子龙;;解开自闭症谜团的钥匙——突触[J];生命的化学;2013年06期

10 李燕燕;;自闭症孩子家长的心声[J];大众心理学;2006年05期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 邹瑾;陈曦;肖振华;王立新;;眼部提示线索对自闭症者面孔加工的影响[A];第十二届全国心理学学术大会论文摘要集[C];2009年

2 张文渊;;自闭症的病因、诊断及心理干预[A];“改革开放与心理学”学术研讨会——湖北省暨武汉心理学会2008年学术年会论文集[C];2008年

3 肖振华;王子姝;王立新;;自闭症者情绪面孔语音视听整合能力的探讨[A];第十二届全国心理学学术大会论文摘要集[C];2009年

4 赵丽琴;;三岁前自闭症幼儿的早期诊断[A];第十二届全国心理学学术大会论文摘要集[C];2009年

5 薛t，

本文编号：1314998