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阿尔茨海默病中内质网应激介导胰岛素信号通路功能障碍及其机制的研究

发布时间:2018-01-06 06:28

  本文关键词:阿尔茨海默病中内质网应激介导胰岛素信号通路功能障碍及其机制的研究 出处:《山东大学》2016年博士论文 论文类型:学位论文


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【摘要】:研究背景:我国现约有阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)患者569万人,在大于65岁老年人中总患病率约3.5%。该病严重危害老年人的身心健康,降低患者及其家属的生活质量。全球用于AD治疗及照料的年支出达6000亿美元。AD给社会和家庭带来极大的负担,是一种对患者及社会均将产生极大危害的疾病。对AD的发病及诊疗进行研究具有极其重要的意义。AD主要临床表现为以近记忆减退为首发症状的认知障碍、行为损害、精神异常,并可伴有日常生活能力受损;其病理变化以β-淀粉样蛋白沉积(Amyloid-beta, Aβ)、细胞内神经纤维缠结、以及神经元丢失为特征。传统AD的发病机制研究主要集中于遗传因素、β淀粉样蛋白级联假说、胆碱能假说、炎症损害、氧化应激及内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)、能量代谢障碍、胰岛素信号通路功能障碍、兴奋性毒性、血管因素等方面。其中,ERS及胰岛素信号通路功能障碍是目前研究的热点。既往研究表明,在脂肪细胞中,ERS下游激酶c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)的激活可导致胰岛素受体底物-1 (Insulin receptor substance-1, IRS-1)丝氨酸磷酸化,从而引起胰岛素信号通路功能障碍,引起脂肪细胞胰岛素抵抗。在肝脏、骨骼肌中有类似结果。但在AD中,是否存在ERS通过某种机制影响胰岛素信号通路仍不清楚。内质网是细胞内蛋白质合成、加工及修饰的场所,大量未折叠及错误折叠的蛋白质在内质网腔中聚集将会引起ERS。ERS发生时,结合免疫球蛋白蛋白(Binding Immunoglobulin protein, BiP)将与肌醇需求酶la (Inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)、双链RNA激活蛋白激酶样内质网激酶(Double strandedRNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、转录激活因子6 (Activating transcription factor 6, ATF6)解离,引起下游通路的激活。早期ERS通常可通过提高蛋白降解、促进分子伴侣表达、抑制蛋白合成等缓解负荷,但如果ERS持续存在或过强,将会引起细胞凋亡。神经元作为有丝分裂后细胞,因不能依赖分裂缓冲应激压力,所以极易发生ERS=AD患者尸检资料证实存在ERS的证据。AD患者大脑BiP表达升高并且与Ap沉积相关,PERK磷酸化增加且与Tau蛋白过磷酸化共定位,海马区IRE1α磷酸化以及颞叶X-盒-结合蛋白1 (X-box binding protein1, XBP1) mRNA剪切增加等。研究表明,Aβ寡聚体处理原代神经元细胞可引起ERS标志物的改变,如BiP表达升高、PERK磷酸化增加、XBP1 mRNA剪切增加以及C/EBP同源蛋白(CEBP homology protein, CHOP)表达增加等。作为ERS的下游激酶,JNK在AD的发病中也起着重要作用。在AD患者尸检资料中,JNK磷酸化水平升高并且和Aβ共定位。AD转基因小鼠皮层及海马组织中磷酸化JNK升高。Aβ寡聚体处理的类神经元细胞及原代神经元均可出现JNK的磷酸化水平升高。腹腔注射JNK抑制剂可改善AD转基因动物行为学表现。JNK3敲除小鼠可出现Aβ1-42水平下降、Ap沉积减少、神经元数量增加及认知的改善。胰岛素信号通路广泛分布于全身各种组织,是维持机体正常生理功能不可或缺的重要传导通路。胰岛素受体为酪氨酸偶联膜受体,当胰岛素与胰岛素受体α亚基结合时,胰岛素受体p亚基发生自体酪氨酸磷酸化,胞质内酪氨酸激酶活性上升,引起IRS-1酪氨酸磷酸化。IRS-1继而招募下游磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K),依次导致下游蛋白激酶B (Protein kinase B, PKB/Akt)及糖原合成酶激酶3β (Glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)激活,以上诸酶联合构成胰岛素PI3K/Akt信号通路。在绝大多数关于胰岛素信号通路功能障碍的研究中,IRS-1都是关键分子。胰岛素与胰岛素受体结合引起IRS-1的酪氨酸磷酸化,从而使信号下传。大多数位点的IRS-1丝氨酸磷酸化则可引起IRS-1与胰岛素受体及下游P13K脱离、IRS-I酪氨酸磷酸化降低,从而抑制胰岛素信号通路下传。IRS-1丝氨酸磷酸化与酪氨酸磷酸化的复杂平衡介导着胰岛素信号通路的状态。有研究显示,多种激酶可导致IRS-1的丝氨酸磷酸化,ERS的下游激酶JNK是其中之一。JNK激活可影响IRS-1307、318及612位点的丝氨酸磷酸化。JNK可作为关键分子,连接ERS及胰岛素信号通路障碍。在涉及学习记忆过程的研究中,胰岛素信号通路处于极为重要的地位。研究表明脑中胰岛素受体在认知敏感区域分布密度高,如海马、杏仁核、内侧颞叶等。经空间记忆训练的实验动物,海马区胰岛素受体敏感性升高,其表达水平、转位及酪氨酸磷酸化状态均发生改变,而特异性阻断海马区胰岛素受体会导致实验动物记忆处理障碍。自1994年Hoyer S首次提出胰岛素信号通路功能障碍作为AD的发病机制起,AD中胰岛素信号通路的改变及其作用逐渐成为研究的焦点。胰岛素信号通路与Ap的产生及清除、神经发生、Tau蛋白过磷酸化、能量代谢及突触功能有关。Ap寡聚体处理原代神经元中,有IRS-1307,612位点丝氨酸磷酸化升高的报道。在AD转基因动物模型3xTg小鼠IRS-1的612位点丝氨酸磷酸化升高。AD患者尸检显示IRS-1的312、616、636(相当于啮齿类307、612、632)位点丝氨酸磷酸化升高以及其下游Akt磷酸化改变。同时,IRS-1616位点丝氨酸磷酸化升高且与神经元纤维缠结共定位。以上说明在AD中,IRS-1丝氨酸磷酸化修饰为胰岛信号通路功能障碍的重要机制。ERS作为AD的早期事件,能够引起下游激酶JNK激活。JNK激活可以介导IRS-1的丝氨酸磷酸化修饰。IRS-1为胰岛素信号通路中的关键分子,其丝氨酸磷酸化修饰可导致胰岛素信号通路功能障碍。ERS、JNK激活以及胰岛素信号通路功能障碍在AD的发病中均有重要意义。前期,我们在9月龄AD转基因小鼠APP/PS1中证实存在ERS,JNK激活以及IRS-1丝氨酸磷酸化。因此,我们提出假设,ERS可导致胰岛素信号通路功能障碍,其可能的机制为ERS引起的JNK依赖性的IRS-1307、318、612位点丝氨酸磷酸化。高分化PC12细胞作为类神经元细胞,经常被用于AD研究。为进‘步验证假说,我们采用来源自Wistar大鼠新生鼠的皮层原代神经元用于实验。Aβ1-42寡聚体在AD脑内最具有神经元毒性,Ap1-42寡聚体干预类神经元或者原代神经元为AD细胞模型造模的首选方法。APP/PS1小鼠插入了人鼠淀粉样前体蛋白Swedish突变以及人类早老素第9个外显子缺失突变的融合体,源于Jackson实验室,为公认的AD转基因动物模型。ERS诱导剂毒胡萝卜素(Thapsigargin, TG)、ERS印制剂4-苯基丁酸钠(4-phenyl butyric acid sodium, PBA)以及JNK抑制剂SP600125均为公认的诱导剂及抑制剂,且PBA及SP600125可跨过血脑屏障。为验证假说,我们采用Aβ1-42寡聚体处理的PC12细胞、皮层原代神经元以及AD转基因动物模型为研究对象,借助ERS诱导剂、ERS抑制剂及JNK抑制剂开展实验。研究目的:1、验证在AD细胞模型及AD转基因动物模型中是否存在ERS及胰岛素信号通路功能障碍。2、明确在AD细胞模型及AD转基因动物模型中ERS是否可引起胰岛素信号通路功能障碍。3、探讨在AD细胞模型及AD转基因动物模型中ERS引起胰岛素信号通路功能障碍的机制。研究方法:1、体外实验:高分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)培养:购自中国科学院细胞库(目录号:TCR9),置于37℃C、含有5%C02的细胞培养箱中,使用添加10%胎牛血清以及100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的高糖DMEM培养。按照实验需求对细胞进行复苏、传代、冻存、干预处理及蛋白收集等操作。皮层原代神经元培养及鉴定:取新生1天内Wistar大鼠乳鼠(购于山东大学实验动物中心)皮层组织,按照步骤分离神经元,置于37℃、含有5%CO2的细胞培养箱中,使用添加有2%无血清B27、0.5%L-谷氨酰胺以及100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的Neurobasal A培养基培养。培养10天的皮层原代神经元用于实验。采用MAP2及GFAP免疫荧光染色方法对神经元进行鉴定。2、体内实验:AD转基因小鼠饲养及鉴定:AD转基因小鼠及相应野生型(Wild type, WT)小鼠购自南京大学南京模式动物研究中心(来源自Jackson实验室)。AD转基因小鼠品系名称为B6C3-Tg (APPswe, PSEN1 dE9) 85Dbo/Mm JNju,简称APP/PS1。饲养室环境温度控制在22±3℃,相对湿度60%,光线自动控制,明(07:00-19:00)暗(19:00-07:00)交替。小鼠饲养按照SPF动物饲养规范进行。繁殖后代小鼠在1月时取鼠尾尖DNA进行基因型鉴定。9月龄APP/PS1转基因小鼠进行Ap免疫组化染色证实皮层有大量Aβ沉积,并有明显水迷宫行为学改变,符合实验需要。APP/PS1及WT小鼠行为学检测:采用Morris水迷宫对不同干预的WT及APP/PS1小鼠进行行为学检测。全过程包含1天适应期(没有平台),连续5天进行的定位航行实验和1天空间探索实验。3、 Aβ1-42寡聚体的制备与鉴定:制备主要按照Rochester医学中心的William J.Bowers教授的方法进行。Aβ1-42寡聚体制备后,采用透射电镜进行鉴定,确定寡聚体形成后保存于-80℃。使用时采用无血清培养基稀释至合适浓度。采用CCK-8检测不同处理条件导致的细胞毒性。4、蛋白表达及磷酸化改变的检测:采用western blotting检测不同处理条件下PC12细胞、原代神经元、WT及APP/PS1、鼠蛋白表达及磷酸化改变。包括:①内质网标志物:BiP, CHOP;② JNK激活:t-JNK, p-JNK Thr183/Tyr185;③胰岛素信号通路功重要分子:t-IRS-1, p-IRS-1 Ser307, p-IRS-1 Ser318, p-IRS-1 Ser612, t-Akt, p-AktSer473;④AD病理改变:t-Tau, p-Tau Thr181。5、ERS相关基因mRNA水平的改变:采用实时荧光定量PCR检测不同处理条件下PC12细胞内质网相关基因mRNA水平改变,包括:BiP、CHOP、ATF4、GADD34、Nrf2、PUMA、TRB3、 XBP1slXBP1u。采用RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳检测XBP1剪切。6、 统计分析:定量数据采用均数士标准差表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,取p值小于0.05为具有统计学差异。使用SPSS 17.0进行统计分析。研究结果:1、Aβ1-42寡聚体增加PC12细胞IRS-1丝氨酸磷酸化为检测胰岛索信号通路功能状态,需要使用基础水平胰岛素刺激,首先进行胰岛素浓度梯度实验。PC12细胞经不同浓度的胰岛素(0,25,50,100以及200nM)处理30 min后,p-IRS-1 Ser30、p-IRS-1Ser318及p-IRS-1Ser612位点丝氨酸磷酸化呈现浓度依赖性升高。在25 nM胰岛素作用30 min后,p-Akt Ser473磷酸化升高,与空白对照组相比有统计学意义(p0.05),而p-IRS-1 Ser30、 p-IRS-1Ser318及p-IRS-1Ser612并未显著升高。因此,在后续实验中我们选择了25nM作为PC12细胞基础胰岛素浓度。参考既往研究,原代神经元的基础胰岛素浓度为1nM。为选择合适的Aβ1-42寡聚体处理条件,进行Aβ1-42寡聚体浓度梯度及时间梯度实验。PC12细胞经不同浓度Aβ1-42寡聚体(0,0.25,0.5,0.75,1以及2 μM,处理时间为120 min)及不同时间(0,15,30,60,120以及240 min,处理浓度为1μM)处理后(在收蛋白之前30 min添加浓度为25 nM胰岛素刺激),p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1Ser318及p-IRS-1Ser612位点丝氨酸磷酸化呈现剂量依赖性以及时间相关性升高。Ap 1-42寡聚体处理(1 μM,120 min)可显著升高p-IRS-1 Ser30、p-IRS-1Ser318及p-IRS-1Ser612磷酸化水平(p0.05),降低p-AktSer473磷酸化水平(p0.05)。因此,在后续实验中,以1 μM和120 min作为Ap1-42寡聚体处理PC12细胞的条件参数。参考既往研究,Aβ 1-42寡聚体处理原代神经元的条件为500 nM及3 h。2、Aβ1-42寡聚体、TG处理可诱发ERS,引起JNK激活并升高IRS-1丝氨酸磷酸化水平在PC12细胞中,Aβ 1-42寡聚体(1 μM,120 min)处理可以引起BiP、CHOP蛋白水平升高(p0.05), BiP、CHOP、ATF4、TRB3、PUMA、GADD34、Nrf-2 mRNA水平升高(p0.05),以及XBPl的剪切。Ap 1-42寡聚体(1μM,120 min)及ERS诱导剂TG (2μM,120 min)可引起p-JNK Thr183/Tyr185磷酸化水平升高(p0.05)以及p-IRS-1Ser307、p-IRS-1Ser318和p-IRS-1Ser612磷酸化水平升高(p0.05)。Aβ 1-42寡聚体(1 μM,24 h)及TG (2μM,24 h)可引起p-Tau Thr181磷酸化水平升高(p0.05)。3、APP/PS1小鼠皮层存在ERS、JNK激活及IRS-1丝氨酸磷酸化水平的升高9月龄雄性APP/PS1转基因小鼠与同月龄同窝雄性WT小鼠相比,皮层BiP及CHOP表达升高(p0.05), p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1 Ser307, p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平升高(p0.05)。4、抑制ERS可降低Aβ1-42寡聚体引起的.INK激活、IRS-1丝氨酸磷酸化在皮层原代神经元以及PC12细胞中,ERS抑制剂PBA预处理(2 mM,3h)可降低Ap1-42寡聚体处理引起的p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318、 p-IRS-1 Ser612以及p-Tau Thr181磷酸化(p0.05)。给予APP/PS1转基因小鼠腹腔注射PBA (200 mg/kg,5周)可改善水迷宫行为学表现,并降低皮层p-JNK Thr183/Tyr185, p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p0.05)。5、抑制JNK激活可降低Aβ1-42寡聚体引起的IRS-1丝氨酸磷酸化在皮层原代神经元以及PC12细胞中,JNK抑制剂SP600125预处理(25 μM, 40min)可降低p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318、p-IRS-1Ser612以及p-Tau Thr181磷酸化(p0.05)。给予APP/PS1转基因小鼠腹腔注射SP600125(30mg/kg,12周)可改善水迷宫行为学表现,并降低皮层p-JNK Thr183/Tyr185、 p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p0.05)。结论:1、在Aβ1-42寡聚体处理的PC12细胞、皮层原代神经元,APP/PS1小鼠中存在ERS及胰岛素信号通路功能障碍。2、在Aβ1-42寡聚体处理的PC12细胞、皮层原代神经元,APP/PS1小鼠中ERS可引起胰岛素信号通路功能障碍。3、在Aβ1-42寡聚体处理的PC12细胞、皮层原代神经元,APP/PS1小鼠中,ERS引起胰岛素信号通路功能障碍的可能机制为JNK依赖性的IRS-1丝氨酸磷酸化。4、在Aβ1-42寡聚体处理的PC12细胞、皮层原代神经元中,ERS/JNK/IRS-1通路的激活可引起Tau蛋白过磷酸化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R749.16


本文编号:1386700

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