超极化激活环核苷酸门控阳离子（HCN）通道对甲基苯丙胺成瘾的调节作用及机制研究

发布时间：2018-02-26 10:03

  本文关键词： HCN通道 甲基苯丙胺成瘾 自身给药 清醒动物微透析 膜片钳　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近年来,在我国以甲基苯丙胺为代表的合成毒品正在逐渐取代经典毒品海洛因等而成为主导毒品。相对传统毒品而言,合成毒品更易成瘾、对成瘾者中枢神经的损伤更严重;此外,合成毒品成瘾还严重危害国家安全、社会稳定、人口素质和公共卫生水平。合成毒品能造成如此严重危害的根本原因是合成毒品成瘾的神经生物学机制尚未完全阐明,没有理想的干预靶标和药物。因此,深入开展合成毒品成瘾神经生物学机制研究,寻找有效的抗合成毒品成瘾的干预药物成为本研究领域最急需解决的关键科学问题。中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元向伏隔核、海马、前额叶皮层、杏仁核等不同脑区的投射构成了奖赏环路,是药物成瘾最重要的神经生物学基础。其中,中脑腹侧被盖区向伏隔核的多巴胺能投射与药物引起的正性强化作用密切相关,是成瘾启动的关键。此外,中脑腹侧被盖区投射到海马、前额叶皮层、杏仁核的多巴胺能神经元构成了复杂的调控网络,改变投射到中脑腹侧被盖区和伏隔核的谷氨酸能神经元功能,与关联性学习记忆相关。成瘾性物质对谷氨酸能神经投射的作用放大了成瘾机体对线索、环境的敏感性,是强迫性用药产生的基础,是引起强迫性用药后复吸的根本因素。中脑腹侧被盖区、伏隔核和海马在药物成瘾的过程中发挥着重要作用。合成毒品甲基苯丙胺引起的强大奖赏效应是其引发成瘾行为的始动因素,而由甲基苯丙胺引起的、奖赏环路细胞外多巴胺类神经递质浓度的快速升高是甲基苯丙胺诱发正性强化效应,形成关联性学习记忆,进一步导致成瘾发生的物质基础。传统的观点认为,甲基苯丙胺主要通过作用于质膜多巴胺转运体和囊泡转运体2,抑制多巴胺重摄取,促进多巴胺逆转运,从而增加细胞外多巴胺水平。然而,这一假说并不能圆满解释甲基苯丙胺成瘾和神经性毒性等全部实验现象。那么,甲基苯丙胺成瘾是否还存在其它的新机制呢?甲基苯丙胺能否直接参与调节神经元功能从而发挥作用呢?这可能为研究甲基苯丙胺成瘾的神经生物学机制和干预策略提供新线索和新思路。超极化激活的环核苷酸门控阳离子(Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated,HCN)通道广泛分布于中枢神经系统,是介导超极化激活非选择性阳离子电流Ih的离子通道。其生理功能包括:(1)调节神经元兴奋性和节律性活动;(2)维持静息膜电位及神经元放电的共振;(3)控制膜电阻和突触整合;(4)影响神经元的突触传递及突触可塑性。基于以上研究,人们认为HCN通道可能参与了情感、认知、神经内分泌等重要生理功能的调节和惊厥、癫痫、神经性痛、帕金森病及年龄相关记忆下降等多种神经精神系统疾病的病理生理学过程。甲基苯丙胺对HCN通道有何作用,HCN通道对神经元兴奋性和突触传递的调节作用,是否可能成为甲基苯丙胺成瘾的新机制?本文首次对HCN通道是否参与甲基苯丙胺成瘾及其可能神经生物学机制开展了较系统的研究工作,初步揭示了甲基苯丙胺上调中脑边缘多巴胺奖赏系统功能的可能新机制,为全面阐明甲基苯丙胺成瘾神经生物学机制提供了新线索,为发现新靶标、研发新药物、防治甲基苯丙胺成瘾提供了新思路。本文的主要具体发现是:一、HCN通道与甲基苯丙胺成瘾的关系(一)干预HCN通道对甲基苯丙胺成瘾行为的影响为了较为全面的研究HCN通道在甲基苯丙胺成瘾过程中发挥的作用,本文以选择性HCN通道阻断剂ZD7288为工具,在多个成瘾模型上观察了干预HCN通道对成瘾行为的调节作用。1、自发活动实验在大鼠活动性实验中,本文首先研究了侧脑室给予选择性HCN通道阻断剂ZD7288对甲基苯丙胺精神兴奋效应的影响。1)侧脑室单次注射ZD7288(0.312,0.625,1.25,2.5μg)不影响大鼠基础活动(P0.05,n=6);2)侧脑室单次注射ZD7288(0.625,1.25μg)显著减弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)诱发大鼠高活动性(P0.01,n=8)。以上结果表明阻断HCN通道减弱甲基苯丙胺的精神兴奋效应(正性强化效应),但对动物基础活动没有影响,提示HCN通道参与了甲基苯丙胺的精神兴奋效应。2、自身给药实验(1)对正性强化效应的影响在自身给药模型中,研究了选择性HCN通道阻断剂ZD7288对甲基苯丙胺正性强化效应的影响。(1)在大鼠自身给药模型固定比率(Fixed Ratio,FR)程序下,研究发现:1)侧脑室伴随给予ZD7288(0.625μg)减弱低剂量甲基苯丙胺(0.0125mg/kg/infusion,i.v.)用药行为的形成(P0.01,n=6-8);侧脑室单次给予ZD7288(0.3125,0.625μg)亦能减弱低剂量甲基苯丙胺(0.0125mg/kg/infusion,i.v.)诱发的用药行为(P0.01,n=8),但对高剂量甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/infusion,i.v.)诱发的用药行为无显著影响(P0.05,n=4-6);2)为了确定HCN通道发挥作用的靶脑区,选择了与奖赏系统关系最为密切的伏隔核进行干预,单次双侧伏隔核注射ZD7288(0.3125,0.625μg/侧)能够显著性减弱高剂量甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/infusion,i.v.)诱发的用药行为(P0.001,n=10)。(2)同样,在大鼠自身给药模型累进比率(Progressive Ratio,PR)程序下研究发现:1)单次侧脑室注射ZD7288(0.3125,0.625μg)减弱甲基苯丙胺(0.05mg/kg/infusion,i.v.)诱发用药动机(P0.01,n=11);2)单次双侧伏隔核注射ZD7288(0.3125,0.625μg/侧)更加显著地减弱甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/infusion,i.v.)诱发用药动机(P0.001,n=9)。以上结果提示在成瘾的形成和维持期HCN通道参与甲基苯丙胺的正性强化效应及其诱发用药动机,伏隔核可能是HCN通道影响甲基苯丙胺奖赏效应的靶核团。(2)阻断HCN通道对复吸的影响1)伴随消退训练侧脑室注射选择性HCN通道阻断剂ZD7288(0.625,1.25μg)不影响甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)诱发的复吸行为(P0.05,n=9-12);2)药物点燃前,单次双侧伏隔核注射阻断剂ZD7288(0.3125,0.625μg/侧)不影响甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)诱发的复吸行为(P0.05,n=8);3)线索点燃前,单次双侧伏隔核注射阻断剂ZD7288(0.3125,0.625μg/侧)不影响药物相关线索诱发的复吸行为(P0.05,n=7-8)。全脑干预HCN通道可能对复吸环路的特异性较差,掩盖了阻断剂的作用。伏隔核核区HCN通道对药物、线索触发复吸的过程可能没有影响,对代偿性适应阶段的作用有待进一步研究。同时,HCN通道的不同亚型在复吸环路中发挥的作用可能不尽相同,不同亚型的作用可能相互拮抗。ZD7288由于对HCN通道各亚型没有选择性,其对复吸行为的影响可能不明显。关于HCN通道不同亚型的作用、其他核团(如前额叶皮层)中HCN通道的作用、以及HCN通道在应激诱发复吸中的作用,还有待进一步研究。3、阻断HCN通道对甲基苯丙胺诱发情境关联性学习的作用在大鼠条件性位置偏爱(Conditioned Place Preference,CPP)实验中,我们研究发现在CPP形成期侧脑室伴随给予选择性HCN通道阻断剂ZD7288(0.625,1.25μg)减弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)诱发CPP效应的形成,提示HCN通道参与甲基苯丙胺诱发情境关联性学习(P0.01,n=10-13)。(二)在甲基苯丙胺成瘾过程中HCN通道m RNA表达的改变以上研究结果提示,HCN通道参与了甲基苯丙胺成瘾行为的调控,那么甲基苯丙胺成瘾过程中,HCN通道的表达又发生了怎样的改变呢?采用经典的自身给药模型,在甲基苯丙胺成瘾的形成、戒断早期、戒断晚期以及药物点燃四个阶段观察HCN通道各亚型蛋白的m RNA水平的表达变化。与没有接触过甲基苯丙胺的空白动物相比,模型组动物:(1)伏隔核中HCN1 m RNA表达水平在形成期、戒断早期、戒断晚期均无显著性变化(P0.05),在药物点燃时显著升高(P0.05);HCN2 m RNA表达水平在形成期升高(P0.01),在戒断早期恢复正常水平(P0.05),在戒断晚期再次升高(P0.05),在药物点燃时有升高的趋势(P0.05)。(n=5-8)(2)海马中HCN1 m RNA的表达水平在形成期有降低的趋势(P0.05),在戒断早期回到正常水平,在戒断晚期和药物点燃时有升高的趋势(P0.05),但药物点燃时相对于形成期显著升高(P0.05);HCN2 m RNA水平的表达在形成期和戒断早期有减少的趋势(P0.05),在戒断晚期有升高的趋势(P0.05),药物点燃时时没有变化(P0.05),但戒断晚期相对于形成期显著升高(P0.05)。(n=4-7)(3)前额叶皮层HCN1 m RNA水平的表达在形成期、戒断早期、戒断晚期和药物点燃时均显著降低(P0.001,P0.001,P0.01,P0.001);HCN2 m RNA水平的表达在形成期、戒断早期有升高的趋势(P0.05),戒断晚期继续升高(P0.05),在药物点燃时又回落(P0.05)。(n=5-7)(4)背侧纹状体HCN1 m RNA水平的表达在形成期、戒断早期、戒断晚期和药物点燃时均显著降低(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01);HCN2 m RNA水平的表达在形成期有升高的趋势(P0.05),后随着戒断点燃逐渐回到正常水平,但变化没有显著性差异(P0.05)。(n=5-7)以上结果提示,HCN1和HCN2通道亚型在成瘾过程中m RNA表达发生改变,HCN通道可能参与甲基苯丙胺成瘾过程。形成期伏隔核HCN2亚型的m RNA表达上调,结合第一部分阻断剂的药效学作用和HCN2激活后兴奋神经元,提示HCN通道参与甲基苯丙胺正性强化作用可能是通过伏隔核的HCN2亚型发挥的。但这仅是m RNA水平的表达变化,需要进一步在蛋白水平进行深入验证。同时,我们的结果提示HCN通道同一亚型在成瘾不同阶段发挥了不同调节作用,这为阐明甲基苯丙胺成瘾全过程的机制提供了新的研究线索。二、HCN通道调节甲基苯丙胺成瘾的机制研究。以上研究结果提示,HCN通道可能参与甲基苯丙胺成瘾,那么其机制又是怎样的呢?本研究分别从神经化学和神经元兴奋性调节两方面进行机制的阐明。1.神经化学机制伏隔核多巴胺和谷氨酸含量的增加是甲基苯丙胺正性强化作用和情境关联学习记忆的物质基础。HCN通道参与甲基苯丙胺的正性强化作用和情境关联学习记忆,那么其对于伏隔核多巴胺和谷氨酸含量的增加是否有影响呢?我们采用清醒动物微透析联合高效液相-电化学/荧光检测技术检测阻断HCN通道对成瘾关键核团伏隔核内神经递质水平的影响,结果发现:(1)侧脑室单次注射阻断剂ZD7288(0.625,1.25μg)减弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)诱发的伏隔核内多巴胺水平的迅速升高(P0.01),但不影响伏隔核内多巴胺基础水平(P0.05);(n=5)(2)侧脑室单次注射阻断剂ZD7288(0.625,1.25μg)减弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)诱发的伏隔核内谷氨酸水平的持久升高(P0.05),但不影响谷氨酸基础水平(P0.05)。(n=4-5)提示甲基苯丙胺对伏隔核内多巴胺和谷氨酸含量的上调作用与其激活HCN通道相关,构成了甲基苯丙胺成瘾的物质基础。2.神经元兴奋性机制那么,HCN通道是如何参与甲基苯丙胺诱发的细胞外神经递质增加的呢?我们采用电生理实验方法,从神经元兴奋性和突触可塑性方面,对HCN通道参与甲基苯丙胺成瘾的机制展开研究,结果发现:(1)以gap-free模式记录细胞的放电活动,发现甲基苯丙胺(1μM)增强了大鼠海马CA1区锥体神经元的动作电位频率,并使细胞膜去极化(P0.05,n=11);TTX(1μM)阻断Na+通道后,甲基苯丙胺仍可使细胞膜去极化(P0.05,n=11);ZD7288(10μM)和TTX(1μM)共同存在的情况下,甲基苯丙胺的作用被逆转(P0.05,n=11)。提示HCN通道参与甲基苯丙胺对神经元放电频率的增强作用。(2)在大鼠海马CA1区锥体神经元上,用TTX(1μM)和Ba Cl2(200μM)阻断Na+通道及Ba2+敏感K+通道电流以分离记录HCN通道电流,甲基苯丙胺在低浓度(0.1,1μM)增强HCN通道电流幅度(P0.001,n=15),但高浓度时(10μM)减少HCN通道电流幅度(P0.001,n=15);使用多巴胺D1/D5受体拮抗剂SCH23390(1,5,10μM)只能部分逆转甲基苯丙胺(1μM)增强HCN通道电流的作用(P0.05,n=7)。提示甲基苯丙胺增强HCN通道电流不仅存在依赖于多巴胺系统的机制,还存在其它的机制。(3)与大鼠海马CA1区锥体神经元上观察到的现象一致,分别在爪蟾卵母细胞表达外源性HCN1和HCN2,甲基苯丙胺在低浓度(0.1,1μM)增强HCN1、HCN2通道电流幅度(P0.05,n=9-10),但高浓度甲基苯丙胺(10μM)减少HCN1、HCN2通道电流幅度(P0.001,n=9-10)。由于爪蟾卵母细胞几乎不表达能够调节HCN通道功能的G蛋白偶联受体,以上结果提示甲基苯丙胺可能直接激活HCN通道。(4)甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)增强大鼠海马Sc-CA1兴奋性突触长时程增强(Long-term Potentiation,LTP)(P0.001,n=12),提前海马CA1区微注射ZD7288(0.625μg)后,甲基苯丙胺诱发的大鼠海马Sc-CA1兴奋性突触LTP增强被抑制(P0.05,n=12),提示甲基苯丙胺诱发的LTP增强依赖于其对HCN通道的激活。以上结果提示,甲基苯丙胺能够增强HCN通道电流,使膜电位向去极化方向移动,增强神经元兴奋性。我们的研究首次发现甲基苯丙胺增强HCN通道电流不仅存在依赖于多巴胺系统的机制,还有可能是甲基苯丙胺对HCN通道的直接作用。同时,甲基苯丙胺通过激活HCN通道增强LTP,诱发海马突触可塑性的改变,参与甲基苯丙胺诱发情境关联性学习。综上所述,本课题首次证明HCN通道参与了甲基苯丙胺成瘾病理生理学过程。首先,在多种动物成瘾模型中,选择性HCN通道阻断剂ZD7288能够显著降低甲基苯丙胺的兴奋性和正性强化作用,及其诱发的情境关联性学习。伏隔核可能是其发挥兴奋性和正性强化作用的关键核团。其次,在甲基苯丙胺成瘾的不同阶段,HCN通道的HCN1和HCN2亚型在不同核团的m RNA水平表达改变,伏隔核中HCN2的表达变化趋势与其阻断后的药效学作用相一致。最后,在神经生物学机制研究中,利用清醒动物微透析和电生理实验,首次发现甲基苯丙胺能通过直接和间接两个途径上调HCN通道功能。一方面,甲基苯丙胺能够直接作用于多巴胺转运体,增加细胞外多巴胺含量,激活多巴胺D1/D5受体,增加细胞内c AMP含量,从而激活c AMP敏感的HCN通道;另一方面,甲基苯丙胺可能直接激活HCN通道。HCN通道的激活使得神经元兴奋性增强,进一步增加神经递质的释放,增强LTP,影响神经元突触可塑性,从而参与甲基苯丙胺的精神兴奋效应、正性强化效应和情境关联性学习,最终引起成瘾行为。本课题的研究为阐明甲基苯丙胺成瘾神经生物学机制提供了新线索,为其治疗药物及策略研发提供了新的理论基础和实验依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.64
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本文编号：1537549