EphB2对Aβ寡聚体诱导的神经毒性损伤和NMDAR信号通路的保护作用

发布时间：2018-05-13 21:42

  本文选题：β-淀粉样蛋白 + EphB2　； 参考：《河北医科大学》2013年博士论文

【摘要】：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种与年龄相关的，以学习记忆减退和认知功能障碍为主要特征的神经退行性疾病。AD的病理学特征为细胞外β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积形成的老年斑，高度磷酸化的tau蛋白形成的神经原纤维缠结，以及脑内神经元和突触的丢失。目前认为Aβ沉积是AD发病的核心环节，AD患者学习记忆的损伤程度与细胞外Aβ沉积密切相关，但Aβ诱导神经毒性损伤的具体机制还不清楚，仍需要进一步研究。 Eph是受体酪氨酸激酶中最大的家族，主要分布在兴奋性突触，在发育过程中参与组织形成，血管的发生和轴突导向等，在成熟的脑内也发挥重要作用，参与突触功能和可塑性的调节。目前的研究主要集中在EphA4和EphB2，这两种受体广泛分布于大脑皮质和海马内。最近研究发现，在AD转基因小鼠Tg2575脑内，EphB2的表达出现年龄和区域依赖性的降低。在hAPP（Human amyloid precursor protein，hAPP）转基因小鼠发病早期，海马内也出现了EphB2表达的降低，在海马齿状回过表达EphB2质粒，能够逆转N-甲基-D-天门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acidreceptor，NMDAR）依赖的长时程增强（long term potentiation，LTP）的降低，同时也恢复了hAPP转基因小鼠的学习记忆障碍，推测EphB2表达的降低与AD的发病机制相关，而AD患者和AD动物模型学习记忆能力下降的主要原因是Aβ的沉积，由此推测EphB2水平的降低可能是Aβ诱导的突触可塑性下降和神经元丢失的原因，目前仍缺乏直接证据。 Aβ寡聚体沉积所引起的神经元功能损伤和神经毒性作用与NMDAR活性的失调有关，谷氨酸能神经元运输和功能失调是AD病理的主要原因之一，NMDAR在突触和突触外位点表达的动态平衡对于神经细胞的存活有着关键性的作用。EphB2通过调节NMDAR的功能而调节谷氨酸能的神经递质传递，很多研究已经证实EphB2在突触可塑性中的关键作用，EphB的激活能够诱导Src激酶-依赖性的NR2B三个酪氨酸残基的磷酸化，这对于调节NMDAR在突触的表达非常重要。敲除EphB1-3三个基因的小鼠，兴奋性突触的数量减少，而只敲除EphB2基因的小鼠，NMDAR在突触的电流降低，海马的LTP也受到抑制，说明EphB2可能对于NMDAR在突触的表达有重要的调节作用。 最近研究发现，NMDAR的激活所诱导的一系列反应决定于NMDAR的亚细胞定位。激活突触NMDAR，促进cAMP反应元件结合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）的磷酸化和细胞的存活，而激活突触外NMDAR，抑制CREB信号途径并导致细胞死亡。在海马神经元，CREB是细胞核Ca2+信号的重要靶标，在神经元存活、突触可塑性以及学习记忆中都具有重要的作用。CREB受到多种信号途径的调节，其中包括细胞丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号途径，而p38MAPK参与了Aβ介导的神经毒性作用以及NMDAR依赖性的LTP抑制。 因此，我们推测在海马神经元内，Aβ诱导的神经毒性作用可能是由于突触和突触外NMDAR的失衡所致，而EphB2则通过调节NMDAR在突触的表达及其下游的p38MAPK和CREB信号通路而对Aβ诱导的神经毒性损伤起到保护作用。本研究通过原代培养的海马神经元，应用MTT、LDH以及形态学方法，观察Aβ1-42的神经毒性损伤作用。以转染EphB2质粒的方法，提高海马神经元内EphB2的表达，进而探讨EphB2对于NMDAR在突触的表达以及p38MAPK和CREB信号通路的影响。第一部分EphB2对Aβ寡聚体诱导的神经毒性损伤的保护作用 目的：观察Aβ1-42对海马神经元的毒性损伤作用以及对EphB2表达的影响，探讨EphB2表达水平与Aβ1-42神经毒性损伤间的关系。 方法：新生1d内SD乳鼠，剥离两侧海马进行体外培养，培养至神经元成熟以后，以NeuN神经元特异性抗体和Hoechst33258双染鉴定神经元纯度，神经元纯度在90%以上的用于后续实验。通过神经元形态学、Hoechst33258染色以及LDH和MTT检测的方法，观察1μM Aβ1-42处理海马神经元1，3，6，24h后，对神经元的毒性损伤作用。Western blot检测Aβ1-42对海马神经元内EphB2表达水平的影响。进一步通过转染EphB2质粒，观察EphB2对Aβ1-42神经毒性损伤的作用。 结果： 1原代培养的成熟海马神经元，胞体较大，周围光晕明显，胞浆饱满，胞核大，神经元突起交织成网络。1μM的Aβ1-42处理1，3，6，24h后，神经元数量随Aβ1-42处理时间的延长呈逐渐减少的趋势，部分细胞胞体肿胀，失去折光性，胞质内出现颗粒，有些胞膜破裂，有大量碎片生成。Hoechst33258染色显示，随着Aβ1-42处理时间的延长，神经元细胞核缩小，染色质断裂凝集显著增多，荧光强度逐渐增加。 2MTT检测细胞存活率，结果显示，在Aβ1-42处理1，3，6，24h后，神经元的存活率逐渐下降，与对照组相比，均存在显著性差异。 3检测培养液中LDH释放率，结果显示，在Aβ1-42处理1，3，6，24h后，LDH释放率随Aβ1-42处理时间的延长而显著增加，与对照组相比，均存在显著性差异。 4Aβ1-42处理海马神经元后，显著降低了EphB2的表达水平，与对照组相比有统计学意义。转染EphB2质粒，增加了海马神经元内EphB2的表达，使Aβ1-42处理后的海马神经元内EphB2的表达恢复到正常对照组水平。 5MTT和LDH检测结果显示，转染EphB2后Aβ1-42处理1h和3h后，细胞存活率升高，LDH释放率下降，与单独Aβ1-42处理1h和3h组相比，均具有统计学意义。转染EphB2后Aβ1-42处理6h和24h后，细胞存活率和LDH释放率与单独Aβ1-42处理6h和24h之间无显著性差异。结果表明在Aβ1-42毒性损伤早期，转染EphB2具有保护作用，因此，后面相关实验Aβ1-42处理的时间均为1h。 结论： Aβ1-42对原代培养的海马神经元具有时间依赖性的毒性损伤作用，同时，Aβ1-42处理海马神经元后，细胞内EphB2的表达水平下降。通过转染EphB2质粒增加神经元内EphB2的表达水平，能够抑制Aβ1-42对海马神经元的毒性损伤作用。第二部分EphB2对Aβ寡聚体诱导的NMDAR在突触表达改变的影响 目的：观察AD动物模型SAMP8小鼠和AD细胞模型中NMDAR在突触表达的变化，并在AD细胞模型中转染EphB2质粒，探讨EphB2对于NMDAR在突触表达的调节作用。 方法：以6月龄SAMP8小鼠作为AD动物模型，通过生物化学方法，分离海马突触蛋白，检测NMDAR各亚基在突触表达的变化。Aβ1-42处理原代培养的海马神经元，应用免疫荧光双标的方法，进一步观察在AD细胞模型中NMDAR各亚基在突触表达的变化。再通过转染EphB2质粒，增加AD细胞膜型中EphB2的表达，进而观察EphB2对于NMDAR各亚基在突触表达的调节作用。 结果： 1Western blot结果显示， NR1、NR2A和NR2B在突触表达占NR1、NR2A和NR2B表达总量的比值在SAMP8、SAMR1和CD-1三组间存在显著性差异，SAMP8小鼠显著低于SAMR1和CD-1小鼠（P＜0.01），SAMR1和CD-1小鼠间没有显著性差异。 2Aβ1-42处理的原代海马神经元，应用免疫荧光双标检测NMDAR三个亚基在突触的表达变化。NR1、NR2A和NR2B在突触表达的量占NR1、NR2A和NR2B表达总量的比值在对照组（Con）与Aβ1-42处理组（Aβ）间存在显著差异，Aβ1-42处理使NR1、NR2A和NR2B在突触的表达分别下降29.18%（P＜0.01）、17.98%（P＜0.01）和24.67%（P＜0.01）。 3在海马神经元内，转染EphB2后Aβ1-42处理组（EphB2+Aβ）显著增加了NR1和NR2B在突触的表达，比单独的Aβ1-42处理组（Aβ）分别增加17.95%（P＜0.01）和19.31%（P＜0.01）。NR2A在突触的表达未受到转染EphB2的显著影响，在转染EphB2后Aβ1-42处理组（EphB2+Aβ）与单独的Aβ1-42处理组（Aβ）之间无显著性差异，仍显著少于对照组（Con）（P＜0.01）。 结论： AD动物模型SAMP8小鼠，NR1、NR2A和NR2B在突触的表达显著下降。Aβ1-42处理的海马神经元也表现出NR1、NR2A和NR2B在突触表达的显著下降，转染EphB2能抑制Aβ1-42诱导的NR1和NR2B在突触表达的降低，但对于NR2A在突触的表达无显著影响。第三部分EphB2对Aβ寡聚体诱导的p38MAPK和CREB信号通路的影响 目的：探讨EphB2在AD细胞模型中对于p38MAPK和CREB信号通路的影响。 方法：Aβ1-42处理原代培养的海马神经元，应用western blot检测p38MAPK和CREB的磷酸化水平。进而通过转染EphB2质粒，增加AD细胞模型中EphB2的表达水平，观察EphB2对于p38MAPK和CREB磷酸化水平的影响。 结果： 1与对照组（Con）相比，p38MAPK磷酸化水平在Aβ1-42处理组（Aβ）显著升高（P＜0.01），转染EphB2后Aβ1-42处理组（EphB2+Aβ）和单独转染EphB2组（EphB2）与对照组间无显著性差异。与Aβ1-42处理组（Aβ）相比，转染EphB2后Aβ1-42处理组（EphB2+Aβ）的p38MAPK磷酸化水平显著降低（P＜0.01），转染对照质粒后Aβ1-42处理组（iEphB2+Aβ）与Aβ1-42处理组（Aβ）间无显著性差异。 2与对照组（Con）相比，CREB磷酸化水平在Aβ1-42处理组（Aβ）显著降低（P＜0.01），转染EphB2后Aβ1-42处理组（EphB2+Aβ）和单独转染EphB2组（EphB2）与对照组间无显著性差异。与Aβ1-42处理组（Aβ）相比，转染EphB2后Aβ1-42处理组（EphB2+Aβ）的CREB磷酸化水平显著升高（P＜0.01），转染对照质粒后Aβ1-42处理组（iEphB2+Aβ）与Aβ1-42处理组（Aβ）间无显著性差异。 结论： Aβ1-42处理海马神经元后，p38MAPK磷酸化水平显著升高，而CREB的磷酸化水平显著降低。过表达EphB2能够抑制Aβ1-42诱导的p38MAPK磷酸化水平的升高和CREB磷酸化水平的降低。 综上所述，本实验以Aβ1-42处理原代海马神经元建立AD细胞模型，应用形态学、MTT、LDH释放率、免疫细胞化学、western blot等方法，研究EphB2对于Aβ1-42神经毒性的保护作用及其可能机制。研究发现Aβ1-42对于海马神经元具有时间依赖性的神经毒性作用，并导致EphB2表达水平的降低。在海马神经元内过表达EphB2能够抑制Aβ1-42对海马神经元的毒性损伤，且在Aβ1-42处理1h的时候，EphB2的保护作用最为显著，因此，本实验采用Aβ1-42处理海马神经元1h的模型来研究EphB2的作用机制。Aβ1-42诱导海马神经元内NR1、NR2A和NR2B在突触的表达显著下降，过表达EphB2能够抑制Aβ1-42诱导的NR1和NR2B在突触表达的降低，提示在Aβ1-42诱导的毒性损伤模型中，EphB2具有调节NMDAR在突触表达的功能。进一步研究发现Aβ1-42诱导的p38MAPK的磷酸化升高以及CREB磷酸化的降低，，都能够通过增加EphB2的表达水平而得以恢复。总之，本研究结果提示EphB2通过提高NMDAR在突触的表达水平，进而促进突触NMDAR下游信号通路p38MAPK和CREB的激活而对Aβ1-42诱导的神经毒性起到保护作用，初步揭示了EphB2神经保护作用的分子机制，为AD的治疗提供了新的思路和方法。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R749.1

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