Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ31-35诱导的HT22海马神经细胞Per1异常表达

发布时间：2018-05-16 21:26

  本文选题：Exendin-4 + Aβ31-35　； 参考：《山西医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)在脑内的异常积聚是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)昼夜节律紊乱的病理基础。研究发现,神经元对胞内钙离子水平变化极度敏感,在过量沉积Aβ的双转基因小鼠脑区中研究发现Aβ积聚的区域钙稳态失衡。而神经系统正常功能的发挥需要钙离子信号的参与。研究发现,周期性的钙离子内流是维持SCN节律性的重要原因。可见钙离子信号与昼夜节律的形成与维持密切相关。per1作为昼夜系统输出途径的重要因子,在调控昼夜节律周期和维持昼夜节律稳定中均发挥重要作用。研究发现,per1基因的表达受钙离子水平变化的影响,但由Aβ引发的钙超载对Per1表达变化的影响目前仍未有报道。本研究将在细胞水平来探讨Aβ31-35引起的钙超载对Per1表达变化的影响。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)长效类似物Exendin-4的神经保护作用已有众多研究报道,我们团队前期研究发现Exendin-4在调节昼夜节律紊乱中具有重要作用,但可能的作用机制不清。本研究以海马神经细胞系HT22为实验对象,检测不同处理组per1 mRNA在各CT时间点的表达变化情况,并在差异最显著的CT时间检测了PER1蛋白的相对表达量及其原位表达情况以及胞内钙离子水平变化来进一步探讨Aβ31-35对Per1表达变化影响及Exendin-4发挥神经保护作用的可能机制。第一部分:Aβ31-35导致HT22海马神经细胞Per1异常表达目的:观察Aβ31-35对HT22细胞存活率、形态及Per1表达变化的影响。方法:将培养细胞随机分为对照组和aβ31-35组,以1%fbs饥饿1h来诱导细胞同步化(ct0);细胞同步化之后对照组用完全培养基继续培养,而aβ31-35组则更换为终浓度为25μmaβ31-35继续培养;mtt法检测细胞存活率;荧光倒置显微镜下仔细观察实验细胞形态并进行拍照;real-timepcr检测不同ct时间per1mrna表达情况,并在差异性最显著的ct时间采用westernblot的方法检测per1蛋白相对表达量并用细胞免疫荧光染色的方法检测了其原位表达情况。结果:经25μmaβ31-35作用24h后细胞存活率为(63±2.34%)显著低于对照组(100±0.66%)且镜下可见aβ31-35作用24h后与对照组相比细胞数量较少,胞体皱缩,变圆细胞增多且细胞形态出现异常;aβ31-35影响per1基因节律性表达且在ct16时,aβ31-35使per1mrna的表达(1.43±0.18)较对照组(0.65±0.11)异常升高(p0.05);进一步在该作用时间点检测了per1蛋白的表达情况,与对照组(1.0±0.07)相比,经aβ31-35处理后per1蛋白相对表达量为(0.59±0.01);同样经aβ31-35处理后与对照组(100.31±0.35%)相比aβ31-35使per1蛋白的荧光强度明显降低(51.76±2.52%,p0.05),差异具有统计学意义。结论:aβ31-35使ht22细胞存活率降低,形态异常及per1表达异常。第二部分:exendin-4改善aβ31-35导致ht22海马神经细胞per1异常表达目的:观察exendin-4预处理1h后对aβ31-35造成的细胞存活率下降、形态改变及per1异常表达可能保护作用。方法:mtt法检测细胞存活率;real-timepcr检测exendin-4预处理1h后各ct时间per1mrna的表达情况,并在差异性最显著的ct时间点采用westernblot的方法检测exendin-4预处理后per1蛋白相对表达量并用细胞免疫荧光染色的方法检测了其原位表达情况。结果:exendin-4预处理1h后能显著提高aβ31-35导致的细胞存活率降低(77±2.68%)且镜下观察发现受损的细胞形态得到部分恢复;exendin-4预处理1h后能部分改善per1基因的异常表达且在ct16时能明显降低aβ31-35导致的异常高表达per1基因水平(0.77±0.17,p0.05);经exendin-4预处理后与aβ31-35组相比per1蛋白的相对表达量明显升高(0.80±0.03,p0.05);同样其蛋白荧光强度值也显著升高(81.18±4.98%,p0.05),差异具有统计学意义。结论:exendin-4能够改善aβ31-35导致的ht22细胞存活率下降、形态异常及per1异常表达。第三部分:exendin-4改善aβ31-35诱导的ht22细胞per1异常表达中的钙离子调节机制目的:探讨aβ31-35导致per1异常表达的可能作用机制及exendin-4的保护作用。方法:Real-time PCR检测Nimodipine预处理1 h后各CT时间per1基因的表达情况;在per1表达差异最显著时间点,采用流式细胞术及钙离子荧光染色的方法检测该时间点细胞内的钙离子水平变化并用细胞荧光强度值的大小来反映。结果:Nimodipine预处理1 h后对Aβ31-35造成的per1异常表达起到同Exendin-4类似的作用效果,在CT16,Nimodipine能明显降低Aβ31-35导致的异常高表达per1基因水平(0.89±0.07,p0.05);进一步检测该时间点细胞的荧光强度,结果发现:Aβ31-35组细胞荧光强度值为(584±31.35)较对照组(356±14.97)显著增强;而经Exendin-4预处理后能明显降低Aβ31-35导致的异常增强的荧光强度(360±26.81),该结果与Nimodipine预处理后降低(446±13.89)异常增强的荧光强度具有同等的效果。结论:Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ31-35导致HT22海马神经细胞Per1异常表达。
[Abstract]:In this study , the effect of A尾31 - 35 on the expression of Per1 expression was studied . The results showed that the expression of per1 mRNA was closely related to the changes of the expression of Per1 . The results showed that the expression of per1 mRNA was closely related to the changes of the expression of Per1 . The expression of per1 gene was detected by MTT assay . The results showed that the expression of per1 gene was significantly increased after 1 h after pretreatment .
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R749.16

【参考文献】

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1 赵学玲;王丽;李亚蒙;原媛;于倩倩;徐云云;李杨;曹秀丽;王晓晖;;Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ_(31-35)诱导的HT22海马神经细胞per1基因异常表达[J];神经解剖学杂志;2016年06期

2 Christian Hlscher;;抗糖尿病药物有助于治疗阿尔茨海默病和帕金森病(英文)[J];生理学报;2014年05期

3 岳兴华;刘晓杰;武美娜;陈晋原;祁金顺;;淀粉样β蛋白抑制大鼠海马theta节律并致行为脱抑制和空间记忆损伤[J];生理学报;2014年02期

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本文编号：1898457