减退的胰岛素信号通路在AD发病机制中的作用及艾塞那肽的神经保护机制

发布时间：2018-07-29 13:45

【摘要】：目的:1)研究减退的胰岛素信号通路在阿尔茨海默病(AD)发病机制中的作用;2)研究艾塞那肽(Ex-4)的神经保护机制。方法:1)取1、4、7、10月龄野生型C57BL/6小鼠和APP/PS1/Tau三重转基因(3×Tg)小鼠进行实验。分别分为正常对照(WT,Tg)组和2型糖尿病(WT+T2DM,Tg+T2DM)组。3个月建立T2DM模型成功后饲养2个月,各组小鼠生长为6、9、12、15月龄。通过体重、血糖检测T2DM对机体代谢的影响;通过Morris水迷宫检测减弱的胰岛素信号对小鼠空间学习记忆能力的影响;通过ELISA检测减弱的胰岛素信号对转入的人APP基因表达的脑内A?42沉积的影响;通过Western blotting检测减弱的胰岛素信号对脑内Tau、神经丝(NFs)、胰岛素受体底物(IRS)和PI3K/Akt/GSK-3β信号通路磷酸化水平的影响。2)取1、4、7、10月龄野生型C57BL/6小鼠和APP/PS1/Tau三重转基因(3×Tg)小鼠进行实验。分别分为正常对照(WT,Tg)组,艾塞那肽(WT+Ex-4,Tg+Ex-4)组,2型糖尿病(WT+T2DM,Tg+T2DM)组,2型糖尿病+艾塞那肽(WT+T2DM+Ex-4,Tg+T2DM+Ex-4)组。3个月造模成功后治疗2个月,各组小鼠生长为6、9、12、15月龄。通过体重、空腹血糖、腹腔糖耐量、胰岛素耐量检测Ex-4对机体代谢的调节作用;通过Morris水迷宫检测Ex-4对不同月龄小鼠空间学习记忆能力的影响;通过ELISA检测Ex-4对A?42沉积的影响;通过Western blotting检测Ex-4对Tau、NFs、IRS和PI3K/Akt/GSK-3β信号通路磷酸化水平的影响。3)以SH-SY5Y细胞为研究对象,用GLP-1受体激动剂Ex-4、低剂量PI3K抑制剂Wortmannin、GLP-1受体拮抗剂Ex9-39研究Ex-4的神经保护机制,分为(Con)组,(Ex-4)组,(Ex-4+W)组,(W)组,(Ex-4+W+Ex9-39)组,(Ex9-39)组。通过MTT检测Ex-4对低剂量wortmannin造成的细胞活力减低现象的保护作用;通过Western blotting检测Tau、NFs、IRS和PI3K/Akt/GSK-3β信号通路磷酸化水平,分析Ex-4的神经保护机制。结果:1)患T2DM的15月龄野生小鼠和6、9、12、15月龄3×Tg小鼠的平均逃避潜伏期较各自对照组延长,穿越隐匿平台次数减少;野生小鼠没有人APP基因,患T2DM的3×Tg小鼠脑内转入的人APP基因表达的A?42的沉积增多;T2DM组小鼠脑内Tau蛋白和神经丝蛋白磷酸化程度加重,IRS蛋白的磷酸化水平降低,PI3K/Akt/GSK-3β信号通路蛋白磷酸化水平降低。2)Ex-4能减轻高脂高糖饮食及T2DM造成的体重、空腹血糖的增加,减轻腹腔糖耐量和胰岛素耐量受损程度,调节代谢改善小鼠胰岛素抵抗的程度。Ex-4可改善减退的胰岛素信号通路对15月龄野生小鼠的空间学习记忆能力的损伤程度及提高6、9、12月龄3×Tg小鼠的空间学习记忆能力,但对15月龄3×Tg小鼠的空间学习记忆能力的保护作用不明显。Ex-4可减轻A?42的沉积,降低Tau、NFs的磷酸化水平,提高IRS及PI3K/Akt/GSK-3β信号通路蛋白的磷酸化水平。3)Wortmannin可抑制PI3K的磷酸化,Ex-4可以提高SH-SY5Y细胞活力,减少p-tau和p-NFs等AD样病变,增加IRS的磷酸化水平,并减轻低剂量Wortmannin对PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的抑制。结论:减退的胰岛素信号可能通过加重Aβ的沉积,使tau和NFs磷酸化增多,而加速AD的病理进程,而且Aβ、磷酸化的tau和NFs可能会进一步损伤IRS和PI3K信号通路,从而加重AD的症状。艾塞那肽能改善3×Tg小鼠的AD症状,减轻低剂量Wortmannin对SH-SY5Y细胞的损伤,其机制可能是通过激活GLP-1受体,进一步激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路,并能提高胰岛素受体底物的磷酸化水平,改善胰岛素抵抗,降低?淀粉样蛋白的沉积,降低细胞骨架Tau蛋白和神经丝的磷酸化水平,改善其功能,减少神经毒性物质的产生,从而减轻神经退行性变的症状。
[Abstract]:Objective: 1) to study the role of the impaired insulin signaling pathway in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD); 2) to study the neuroprotective mechanism of Ex-4 (1) to take 1,4,7,10 months old wild C57BL/6 mice and APP/PS1/Tau three heavy transgenic (3 x Tg) rats to be divided into normal control (WT, Tg) and type 2 diabetes mellitus (WT). +T2DM, Tg+T2DM) group.3 months established T2DM model after 2 months of success, mice in each group grew to 6,9,12,15 months. Blood glucose was used to detect the effect of T2DM on body metabolism through body weight; the effects of impaired insulin signals on the learning and memory ability of mice were detected by the Morris water maze, and the weakened insulin signal was transferred through ELISA detection. The effect of APP gene expression on A? 42 in the brain, and the effects of insulin signals weakened by Western blotting on Tau, nerve filament (NFs), insulin receptor substrate (IRS) and PI3K/Akt/GSK-3 beta pathway phosphorylation in the brain by Western blotting to take 1,4,7,10 month old wild type C57BL/6 mice and APP/PS1/Tau three transgenic mice (3 *) mice The experiments were carried out. They were divided into the normal control (WT, Tg) group, WT+Ex-4 (Tg+Ex-4) group, group 2 diabetes (WT+T2DM, Tg+T2DM), and the group of type 2 diabetes + Tg+T2DM+Ex-4 (Tg+T2DM+Ex-4) group for 2 months after.3 months, and the mice in each group grew to 6,9,12,15 months. The effects of Ex-4 on the metabolism of the body were detected; the effect of Ex-4 on the spatial learning and memory ability of mice of different months of age was detected by the Morris water maze; the effect of Ex-4 on the deposition of A? 42 was detected by ELISA; and the effects of Ex-4 on the phosphorylation level of Tau, NFs, IRS and beta signaling pathway were detected by Western blotting. GLP-1 receptor agonist Ex-4, low dose PI3K inhibitor Wortmannin, GLP-1 receptor antagonist Ex9-39 to study the neuroprotective mechanism of Ex-4, divided into (Con) group, (Ex-4+W) group, (W) group, (Ex-4+W+Ex9-39) group, (Ex-4+W+Ex9-39) group. Western blotting was used to detect the phosphorylation level of Tau, NFs, IRS and PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling pathway, and the neuroprotective mechanism of Ex-4 was analyzed. Results: 1) the average escape latency of 15 month old wild T2DM mice and 6,9,12,15 month old 3 x Tg mice was longer than those of the control group, and the number of traversing hidden platforms decreased; there was no APP gene in wild mice and T2. The deposition of A? 42 in human APP gene expression in the brain of DM 3 * Tg mice increased; the degree of Tau protein and neurofilament phosphorylation in the brain of T2DM mice increased, the level of phosphorylation of IRS protein decreased, and the level of phosphorylation of PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling protein decreased.2) Ex-4 can reduce the weight of high fat diet and T2DM, fasting blood glucose Increasing the degree of impaired glucose tolerance and insulin tolerance, and regulating the degree of metabolic improvement of insulin resistance in mice,.Ex-4 can improve the impairment of the impaired insulin signaling pathway to the spatial learning and memory ability of 15 month old wild mice and improve the spatial learning and memory ability of 6,9,12 month old 3 x Tg mice, but to 15 month old 3 x Tg. The protective effect of the spatial learning and memory ability of mice is not obvious.Ex-4 can reduce the deposition of A? 42, reduce the phosphorylation level of Tau, NFs, and increase the phosphorylation level of IRS and PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling protein.3) Wortmannin can inhibit the phosphorylation of PI3K, Ex-4 can increase the activity of SH-SY5Y cells, reduce p-tau and other kinds of pathological changes. The level of phosphorylation and reducing the inhibition of the low dose of Wortmannin on the PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling pathway. Conclusion: the reduced insulin signal may increase the phosphorylation of tau and NFs by aggravating the deposition of A beta and accelerating the pathological process of AD, and A beta, tau and NFs phosphorylated may further damage the IRS and PI3K signaling pathways, thereby aggravating AD. It can improve the AD symptoms of 3 x Tg mice and reduce the damage of low dose Wortmannin to SH-SY5Y cells. The mechanism may be to activate the GLP-1 receptor, further activate the PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling pathway, and improve the phosphorylation level of the insulin receptor substrate, improve insulin resistance, and reduce the deposition of amyloid protein. Reducing the phosphorylation level of cytoskeletal Tau protein and neurofilament, improving its function, reducing the production of neurotoxic substances, thereby alleviated the symptoms of neurodegenerative changes.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16

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本文编号：2152864