Exendin-4改善Aβ31-35所致小鼠海马HT22神经细胞Per2异常表达及机制研究

发布时间：2018-10-26 14:50

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)作为常见的神经退行性疾病之一,患者早期就出现明显紊乱的昼夜节律,而这会进一步加重AD患者后期的学习记忆损伤及认知功能障碍。作为AD重要病理特征之一的β淀粉样蛋白(Amyloid-beta protein,Aβ)异常沉积与疾病的发生发展密切相关,近年来更被证实与昼夜节律紊乱也高度相关。per2基因作为昼夜节律系统的核心组成成分,在昼夜节律的产生及维持中发挥着重要作用,其异常表达会导致昼夜节律紊乱的发生。然而Aβ对Per2(per2 m RNA和PER2蛋白的总称)的影响及其中可能涉及的机制尚不明确。此外,近年来胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)的长效类似物如Exendin-4,已被证实对AD昼夜节律紊乱具有改善功效,然而Exendin-4能否改善表达紊乱的Per2及其中可能涉及的机制仍缺乏理论及实验支持。因此,本研究独创性地以Exendin-4干预小鼠海马HT22神经细胞,通过显微镜下观察及MTT细胞毒性实验证实Exendin-4对Aβ31-35所致细胞形态结构破坏及存活率降低均有改善作用。并进一步通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)及细胞免疫荧光染色法证实Exendin-4能显著拮抗并部分逆转由Aβ31-35所致Per2的异常表达,更初步揭示了胰高血糖素样肽-1受体(Glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)在Exendin-4发挥保护作用中的重要作用。本文拟通过以上研究,为Exendin-4改善AD患者昼夜节律紊乱的研究提供进一步的理论和实验支持。第一部分Aβ31-35引起小鼠海马HT22神经细胞Per2异常表达目的:从细胞水平分别观察不同剂量Aβ31-35对per2基因及PER2蛋白表达的影响。方法:采用小鼠海马HT22神经细胞作为研究对象,将小鼠海马HT22神经细胞分为:对照组,(0、1、2.5、5、10μM)Aβ31-35处理组。不同剂量Aβ31-35处理后的细胞存活率采用MTT细胞毒性实验进行检测。Aβ31-35对细胞形态结构的影响采用荧光倒置显微镜进行观察。不同CT(circadian time,CT)时间点Aβ31-35对per2 m RNA的影响采用RT-PCR检测。在CT16时Aβ31-35对PER2蛋白的影响采用免疫荧光染色法进行观察。结果:(1)使用0、1、2.5、5、10μM的Aβ31-35分别处理细胞24 h后,各处理组细胞存活率分别为(100.00±2.56)%、(98.07±2.56)%、(94.86±1.13)%、(85.06±2.40)%、(80.56±1.13)%,经5、10μM Aβ31-35处理后细胞存活率与对照组相比显著降低(P0.05)。(2)经5μM Aβ31-35处理细胞24 h后,细胞密度整体降低,胞体有轻微的浑浊,局部细胞出现形态皱缩甚至变圆。(3)经1μM Aβ31-35处理后,per2 m RNA在各CT时间的表达与对照组均无显著差异。经5μM Aβ31-35处理后,per2 m RNA在CT16时表达为(0.83±0.14),与对照组(1.24±0.14)相比显著降低(P0.05)。(4)在CT16时PER2蛋白的荧光强度为(60.25±3.25)%,与对照组(100.00±3.47)%相比也显著降低(P0.05)。结论:5μM Aβ31-35会引起HT22神经细胞Per2的表达发生异常。第二部分Exendin-4拮抗Aβ31-35所致小鼠海马HT22神经细胞Per2异常表达目的:从细胞水平观察经Exendin-4预处理对5μM Aβ31-35所致HT22神经细胞Per2异常表达有无改善作用。方法:HT22神经细胞被分为:对照组,Aβ31-35处理组,Exendin-4预处理组,Exendin-4单独处理组。在荧光倒置显微镜下观察Exendin-4能否改善5μM Aβ31-35引起的细胞形态结构的改变。采用MTT细胞毒性检测经Exendin-4预处理5μM Aβ31-35引起的HT22神经细胞存活率下降能否被逆转。采用RT-PCR检测Exendin-4对5μM Aβ31-35引起的HT22神经细胞per2 m RNA表达水平降低的影响。采用免疫荧光染色检测Exendin-4能否拮抗5μM Aβ31-35引起的HT22神经细胞PER2蛋白表达降低。结果:(1)经100 n M Exendin-4预处理,细胞形态较5μM Aβ31-35处理组有明显改善,细胞整体密度有所提高,胞体清澈透亮,形态结构较好。(2)经Exendin-4预处理后细胞存活率为(94.73±2.18)%,与5μM Aβ31-35处理组(84.76±3.07)%相比有显著提高(P0.05)。(3)在CT16时,经100 n M Exendin-4预处理后per2 m RNA的表达为(2.40±0.06),与5μM Aβ31-35处理后相比明显升高(P0.05)。(4)在CT16时,经100 n M Exendin-4预处理后PER2蛋白的荧光强度为(91.35±9.95)%,较5μM Aβ31-35处理后显著升高(P0.05)。结论:Exendin-4对Aβ31-35所致HT22神经细胞Per2的表达异常具有拮抗作用。第三部分Exendin-4通过上调GLP-1R拮抗Aβ31-35所致小鼠海马HT22神经细胞Per2异常表达目的:进一步对Exendin-4显著拮抗Aβ31-35所致HT22神经细胞Per2异常表达中GLP-1R的作用进行探讨。方法:将HT22神经细胞分为:对照组,Aβ31-35处理组,Exendin-4预处理组,Exendin-4单独处理组,Exendin-4+Exendin(9-39)处理组,Exendin-4+Exendin(9-39)预处理组,Exendin(9-39)单独处理组。采用免疫荧光染色在CT16时检测Exendin-4能否部分逆转Aβ31-35所致HT22神经细胞GLP-1R表达降低。使用Exendin(9-39)抑制GLP-1R后,采用免疫荧光染色检测经Exendin-4预处理能否逆转由Aβ31-35所致HT22神经细胞PER2蛋白表达降低。结果:(1)经5μM Aβ31-35处理细胞后GLP-1R的荧光强度为(38.66±2.56)%,与对照组(100.00±1.37)%相比显著降低(P0.05);而经100 n M Exendin-4预处理后GLP-1R的荧光强度(105.12±1.37)%较Aβ31-35处理组显著升高(P0.05)。(2)经100 n M Exendin-4单独处理后GLP-1R的荧光强度为(110.65±2.67)%,与对照组GLP-1R的荧光强度(100.00±2.49)%相比显著升高(P0.05)。而经100 n M Exendin-4和10μM Exendin(9-39)共同处理后GLP-1R的荧光强度为(99.11±0.89)%,与100 n M Exendin-4单独处理后相比显著降低(P0.05)。(3)经100 n M Exendin-4+10μM Exendin(9-39)预处理后PER2蛋白的荧光强度为(51.92±2.00)%,与100 n M Exendin-4预处理后(91.35±9.95)%相比显著降低(P0.05)。结论:上调GLP-1R的表达极有可能是Exendin-4拮抗Aβ31-35引起的HT22神经细胞Per2异常表达的重要机制之一。
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【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R749.16

【参考文献】