阿尔茨海默病磁共振诊断磁对比剂及药物、细胞治疗的实验研究

发布时间：2018-10-29 18:03

【摘要】：研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以慢性进行性痴呆为主要表现的神经退行性疾病，是老年性痴呆最常见的原因之一，其发病率随年龄的增高而不断增高，给社会家庭带来了沉重的经济负担。然而，AD在诊断、治疗等方面仍然比较滞后，本课题通过对目前比较热门的一些技术方法和治疗手段的探讨，来寻找未来可能应用于AD的方法和方向。在AD的诊断方面，磁共振成像（magnetic resonanceimaging，MRI）是一种很有前景的检测AD中β淀粉样蛋白（β-amloid，Aβ）沉积的诊断技术，使用磁共振对比剂既能够提供Aβ沉积的特异性成像以区分其他病理生理结构，又能缩短成像时间。而在AD的治疗方面，早期对血管功能的保护可能成为针对发病机理的治疗新靶点，而晚期神经元的丢失也可能通过细胞移植的方法进行功能重建。目的 1.开发一种使用超小超顺磁性氧化铁（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）纳米颗粒连接功能性蛋白的磁共振对比剂，从而给检测Aβ沉积提供方法。 2.用于治疗脑缺血的药物丁苯酞，，具有内皮保护作用，通过观察其对Aβ损伤下脑微血管内皮细胞（cerebral microvascular endothelial cells，CMECs）的作用，寻找丁苯酞用于AD治疗的证据并进行初步的机制探讨。 3.神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是中枢神经系统疾病细胞移植治疗的最终应用形式，但存在定向分化问题。拟通过观察与CMECs共培养后NSCs在正常条件下和损伤条件下的分化情况，寻找一种能够促使移植治疗应用于神经退行性疾病的解决方案。方法 1.磁共振对比剂由USPIO纳米颗粒连接Aβ16-20（KLVFF）和跨膜蛋白转导结构域（trans-activating transcriptor-protein transduction domain，Tat-PTD）组成，其中Aβ16-20是能特异性与Aβ沉积结合的探针，Tat-PTD能帮助对比剂穿过血脑屏障（brain bloodbarrier，BBB）。体外实验研究此对比剂的生物膜穿透性、生物毒性、与Aβ沉积的特异性结合能力以及对组织磁共振信号的影响；最终将其注射入AD转基因小鼠来进行活体磁共振成像及组织学验证。 2.建立CMECs原代培养方法并鉴定。使用不同浓度丁苯酞预处理CMECs后予以Aβ损伤，观察其活性和凋亡率的变化，并进一步观察其分泌NO及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）水平的变化。 3.共培养原代CMECs和NSCs，观察NSCs的生长状况，移除CMECs后将NSCs分别置于正常培养环境和缺糖缺氧（Oxygen-glucose deprivation，OGD）环境中分化以观察分化比例。鼠胚成纤维细胞（mouse embryo fibroblast，MEF）与NSCs共培养作为对照组。结果 1.Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20的蛋白连接效率达97.75%，体内、体外实验均显示其能穿过生物膜，与Aβ沉积特异性结合，并能降低组织的磁共振信号，与未连接的Aβ16-20及Aβ1-40相比没有发现明显的毒性作用。 2.成功建立了乳小鼠CMECs的原代培养方法，最终阳性率可达95.5%。丁苯酞预处理后的Aβ损伤CMECs，细胞活性升高，凋亡率降低，NO分泌增高，iNOS分泌及胞浆表达均增高，而eNOS分泌及胞浆含量未发现有显著变化。 3.与CMECs共培养的NSCs数量更多，直径更大，不论是在正常培养环境下还是在OGD环境下，神经元分化比例均高于对照。结论 1.本研究设计的磁共振对比剂能够穿过BBB，并能通过磁共振检测到AD动物模型体内的Aβ沉积，是一种很有潜力的AD诊断技术。此外，还有助于开发和评估新的以减少Aβ沉积为目标的AD药物。 2.丁苯酞可能通过提高iNOS的表达和分泌，从而提高NO水平来对Aβ损伤的CMECs产生保护作用，且大剂量下保护作用更明显和稳定，故而有可能通过保护内皮功能而对AD产生治疗作用。 3. CMECs能够促进NSCs的存活和增殖，不仅能促进其在正常培养条件下，也能促进其在损伤条件下更多的向神经元分化。这为研究NSCs在中枢神经系统疾病的细胞治疗中的定向分化问题提供了新证据。创新点 1.创造性开发出新型纳米磁共振对比剂，既为AD临床体内诊断应用打下基础，也为新药开发研究提供了评估手段。 2.建立了一种经济、简易、重复性好、纯度高的CMECs原代培养方法。 3.通过AD发病机理的新观点，探讨在临床上应用于脑缺血的药物丁苯酞用于AD治疗的可能，为增加新的适应症提供一定的依据。 4.在细胞移植治疗中的神经干细胞定向分化问题上，着重探讨了在损伤环境中的分化状况，更接近真实的移植状况。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R749.16

【参考文献】