小儿多发性抽动症多巴胺系统的分子机制及静安口服液作用机理研究

发布时间：2018-11-14 19:34

【摘要】：背景：基于小儿多发性抽动症(Multiple tics,MT)与多巴胺(DA)系统病理生理的密切联系,及近年来在MT研究中神经解剖学及神经生化学方面的发现,多巴胺系统功能异常被广泛认为是导致MT发病的主要病理学基础,但目前MT的确切发病机制从分子及细胞水平均不明确。目的：力求通过以下实验初步揭示小儿多发性抽动症多巴胺系统多位点功能紊乱的分子机制,分析静安口服液对该系统神经递质、代谢转运过程、突触后受体表达及信号传导蛋白表达等多靶点的调节作用。方法：本研究回顾及总结了小儿多发性抽动症的中西医研究进展；在前期研究成果的基础上,采用了DOI[1-(2,5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane,选择性5-HT(2A/2C)受体激动剂]致抽动大鼠病理模型,40只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、静安组及硫必利组,每组10只。60例患儿随机分为静安组及硫必利组,每组30例,并选取30名健康儿童(健康组)作为对照。用高效液相色谱法(HPLC)测定了60例MT患儿治疗前后血浆DA、高草香酸(HVA)等神经递质及代谢产物的含量,并与30例健康儿童比较；同时测定了模型动物脑组织及外周血DA、HVA等神经递质及代谢产物的含量。用RT-PCR法测定了模型动物脑组织几茶酚胺氧位甲基转移酶(COMT)的基因农达水平,用放射免疫方法观察了模型动物多巴胺转运体(DAT)的脑内分布情况,此二者足DA在突触间隙转运、降解等代谢过程的重要物质；分别用RT、PCR法及激光共聚焦显微镜测试了模型动物脑组织多巴胺D1、D2受体的表达水平；分别用免疫组化染色和Western Blot检测了模型动物脑组织纹状体DARPP-32总蛋白表达及Phosphor-Thr-34-DARPP-32磷胺化水平。结果：1.与健康组(16.22±4.95ng/ml)比较,治疗前患儿组血浆HVA[静安组(21.27±11.41ng/ml)和硫必利组(19.94±9.29ng/ml)]含量明显增加(P0.05)：模型组大鼠脑组织DA(1108.98±241.18ng/g)、HVA(96.29±23.88ng/g)均较空白组(547.66±207.84ng/g,65.53±17.93ng/g)显著升高(P0.01)。与本组治疗前比较,治疗后静安组HVA含量(13.65±10.81ng/ml)显著降低(P0.05),硫必利组DA(12.33±11.12ng/ml)含量显著降低(P0.05)。治疗组大鼠脑组织DA[静安组(669.67±167.59ng/g)和硫必利组(759.17±144.42ng/g)]、HVA[静安组(77.92±8.76ng/g)和硫必利组(68.99±11.42ng/g)]较模型组明显减低。 2.模型组大鼠脑内纹状体(5.43±1.39)、大脑皮层(4.61±1.58)、海马(4.06±1.34)中DAT的脑内放射性摄取比值均较空白组(3.03±0.83,2.490.72,1.98±0.75)明显增高(P0.05)。治疗组(静安组与硫必利组)脑内纹状体(3.16±1.28,3.21±0.97)、大脑皮层(2.58±1.44,2.40±0.97)、海马(2.42±1.08,2.18±1.30)放射性摄取比值均较模型组明显降低(P0.05)。 3.与空白组(0.62±0.25)相比,模型组纹状体中COMTmRNA(0.22±0.17)表达明显降低(P0.05)。静安口报液对COMT mRNA的表达无影响。 4.模型组大鼠大脑皮层中DRD1(0.22±0.76)较空白组(0.13：±0.51)表达明显增高。静安组(0.11±0.61)及硫必利组(0.05±0.03)DRD1较模型组明显降低(P0.05)：硫必利组与空白组比明显降低(P0.05)。 5.免疫组化染色显示模型组大鼠纹状体DARPP-32总蛋白阳性细胞数(490.47士186.77)和阳性颗粒光密度(52.62士25.22)均较空白组(325.73±137.57,24.36±10.69)明显升高(P0.05)；Western blot显示模型组DARPP-32总蛋白表达(1.44±0.24)较空白组(1.00±0.32)显著增高(P0.05)；Phosphor-Thr-34-DARPP-32蛋白表达达各组无显著性差异(P0.05)。静安组(374.33±160.79)与硫必利组(24.76±10.65)的阳性颗粒光密度均较模型组显著降低(P0.05)；与静安组相比较,硫必利(13.19±4.02)作用更强(P0.05)。硫必利组DARPP-32总蛋白表达(1.06±0.29)较摸型组显著降低(P0.05)。结论：1.中枢神经系统内DA系统功能亢进参与了MT发病的病理生理机制,表现在DA活动过度(指DA及HVA含量增高、DAT及DRD1活动亢进)及介导神经递质和电活动的信号传导分子DARPP-32总蛋白表达增高：可推测其导致MT发生的分r机制具体现为：DA小体从囊泡释出后,突触前膜上表达亢进的DAT促使其中吸收增加,使DA累积增加；突触后膜DRD1超敏感,使DA神经元与之相结合增强,引起效应细胞的反应活动过度;DARPP-32总蛋白表达增高(除DAKPP-32的Thr34位点之外的其他位点磷酸化所致)可促进DA突触信息传递效率上调DA能神经元生物活性增高,即可导致DA系统功能亢进。COMTmRNA表达降低,或许参与了MT发主见的病理生理机制。 2.关于静安口服液的作和机制及效应位点：①通过减少DA、HVA的含量,降低DA神经元的兴奋性,使模型动物减少抽动;②通过降低纹状体、大脑皮层、海马DAT脑内分布密度,减少突触间隙中DA的回收及再利用,从而降低突触前DA神经元的过度支配和靶器官活动亢进,使模型动物减少抽动；③通过抑制大脑皮层DRD1基因表达水平,降低了突触后DRD1的超敏感性,减少DA神经元之相结合而引起的活动亢进,从而使模型动物减少抽动。④通过降低DARPP-32总蛋白表达水平，，降低DA突触信息传递效率,抑制DA神经元的兴奋性,从而使模型动物减少抽动。总之,静安口服液通过对DA及HVA的含量、突触间隙DA的代谢转运和突触后受体的敏感性及信号传导分子表达水平的调节,使它们之间相互影响,相互调节,共同维持了DA系统对运动调节的稳定状态,使机体的运动正常,体现出其作用结果的整体性。本课题初步揭示了小儿多发性抽动症DA系统的某些分子机制,阐释了静安口服液的作用机理及靶点,同时这一机制的探讨也为MT专病新药的开发研究提供了新的靶点和思路。
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【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R749.94

【引证文献】