小窝蛋白-1在吗啡诱导小鼠原代培养大脑皮层神经元结构可塑性改变中的作用

发布时间：2018-11-26 21:49

【摘要】：背景作为阿片类镇痛药,吗啡在疼痛治疗中应用十分广泛,但药物滥用、误用或长期用药引起的药物依赖不容忽视。目前认为,长期反复应用吗啡可引起敏感神经元发生可塑性变化,是阿片类药物成瘾的机制。小窝蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)在神经系统分布广泛,作为膜脂筏(Membrane lipid rafts,MLRs)绞手架蛋白,与神经可塑性密切相关。然而Cav-1在吗啡所致的神经结构可塑性改变中的作用尚缺乏深入研究。本研究探讨了在吗啡诱导原代培养小鼠皮层神经元结构可塑性改变过程中,Cav-1对神经突生长标志物生长相关蛋白43(Growth association protein-43,GAP-43)和微管相关蛋白2(Microtube-associated protein-2,MAP-2)表达水平的影响。方法分离培养出生24 h内的C57/BL/6小鼠皮层神经元。首先建立慢性吗啡暴露浓度梯度模型,于培养第7天将神经元分为4组,对照组(Control)给予等体积磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS),其它3组为吗啡组(Morphine),分别给予1.0、10.0、100.0μmol/L吗啡处理,继续培养48 h,引起神经元慢性吗啡暴露,通过MTT方法检测神经元活性,通过免疫蛋白印记检测Cav-1表达水平,明确吗啡浓度对神经元活性和Cav-1表达的影响。选取既对神经元活性无影响又诱导Cav-1增加的吗啡浓度10.0μmol/L进一步研究,通过q RT-PCR方法探讨吗啡对神经元Cav-1转录水平的影响,通过蛋白免疫印迹和免疫荧光检测吗啡对生长相关蛋白-43(Growth associated protein-43,GAP-43)、微管相关蛋白2(Microtube-associated protein-2,MAP-2)等神经可塑性标志物改变情况,验证神经突生长。继之,通过Cav-1敲减技术,研究Cav-1在吗啡诱导原代培养小鼠皮层神经元结构可塑性改变中的作用。将原代培养小鼠皮层神经元分为3组:对照组(Control)不进行特殊处理;无义序列组(sh RNASc组)转染携带无义序列sh RNA的慢病毒,使复感染指数(Multiplicity of Infection,MOI)为1;Cav-1敲减组(sh RNACav1组转染携带Cav-1 sh RNA的慢病毒(Lentish RNACav1),使MOI为1。7天后将上述每组再次各分为2个亚组,分别给予等体积PBS或10.0μmol/L吗啡,继续培养48 h。通过免疫蛋白印迹检测Cav-1、GAP-43等目的蛋白,通过免疫荧光激光共聚焦和高内涵分析系统对Cav-1和微管相关蛋白-2(Microtube associated protein-2,MAP-2)表达及神经元轴突长度等形态学参数进行检测。结果1)MTT分析表明,10μmol/L吗啡对神经细胞活性无影响,同时蛋白免疫印迹表明该浓度吗啡可诱导Cav-1水平升高。2)q RT-PCR结果显示10μmol/L吗啡可引起Cav-1 m RNA水平升高,在转录水平促进Cav-1表达。蛋白免疫印迹和免疫荧光表明吗啡可引起GAP-43水平升高及MAP-2为标记的神经突生长。3)通过慢病毒介导的Cav-1敲减,可抑制吗啡所致的GAP-43表达增加及MAP-2标记的神经突延长。结论吗啡可引起小鼠原代培养皮层神经元结构可塑性改变,Cav-1在该过程中发挥重要作用。抑制Cav-1表达,可减少吗啡引起的神经生长标志物GAP-43和MAP-2的增加,神经生长受抑。提示Cav-1可能是干预吗啡成瘾的潜在分子靶点。
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【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R749.61

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