Curcumin通过增强Rab7表达促进自噬体的轴突运输

发布时间：2019-04-09 10:14

【摘要】：目的:阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的中枢神经系统退行性变性疾病。自噬作为一种真核细胞内重要的蛋白质降解途径,与AD的发生发展密切相关。自噬体大量堆积在轴突末端不能与溶酶体结合不仅影响了Aβ的代谢,更容易引起自噬应激导致神经细胞死亡。Rab7是一种小GTP酶,在自噬体的成熟以及自噬体与溶酶体的融合中都发挥着重要作用。研究表明,curcumin(姜黄素)作为一种多酚类植物化合物,在AD中起神经保护作用,但其作用机制尚有待进一步研究。本研究拟通过体外研究的方法,首先验证curcumin减少Aβ的沉积以及对AD的神经保护作用;再观察curcumin对自噬及自噬流的影响;紧接着进一步研究其对自噬体轴突运输的作用;最后探讨其作用机制是否与Rab7的表达有关。本研究选择一个新的视角探讨curcumin对AD的作用机制,为AD的治疗提供新的靶点、新的思路。方法:首先将细胞分为4组:WT组(N2a/WT细胞)、Control组(N2a/APP695swe细胞)、Sham组(经5μM DMSO溶液处理24h的N2a/APP695swe细胞)、Curcumin组(经5μM curcumin溶液处理24h的N2a/APP695swe细胞)。流式细胞术用于检测各组细胞凋亡率和线粒体膜电位的变化。ELISA实验用于检测各组细胞上清液中Aβ的表达。通过透射电镜和激光共聚焦显微镜进一步观察各组细胞中自噬体及自噬溶酶体数量的变化,并运用Western Blot检测LC3II、SQSTM1、Beclin1、Atg7、Atg16L1、Dynein、KIF3B以及Rab7的表达。q RT-PCR用于检测Rab7在分子水平的表达。然后进一步在N2a/APP695swe细胞中转染pc DNA3.1、pc DNA3.1-Rab7、NC-si RNA、Rab7-si RNA后,将细胞分为5组:Control组、pc DNA3.1组、pc DNA3.1-Rab7组、NC-si RNA组、Rab7-si RNA组,再次用流式细胞术检测各组中细胞凋亡率和线粒体膜电位的变化,ELISA检测各组中Aβ的表达,透射电镜和激光共聚焦显微镜观察各组细胞中自噬体及自噬溶酶体数量的变化,Western Blot检测LC3II、SQSTM1、Dynein、KIF3B蛋白的表达情况。结果:与Control组相比,经curcumin处理细胞24h后,细胞凋亡率明显降低(P=0.000),线粒体膜电位升高(P=0.000),细胞上清液中Aβ的含量减少(P=0.000);透射电镜和激光共聚焦显微镜均显示自噬体增加,且自噬溶酶体数量也增加;Western Blot检测发现LC3II、Beclin1、Atg7、Atg16L1、Dynein以及Rab7的表达均增多(P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.003;P=0.000;P=0.000),而SQSTM1和KIF3B的表达降低(P=0.000;P=0.000);q RT-PCR结果显示Rab7在m RNA水平表达也有所增加(P=0.000)。在N2a/APP695swe细胞中转染Rab7过表达载体后,与Control组相比,细胞凋亡率降低(P=0.000),线粒体膜电位增加(P=0.000),细胞上清液中Aβ的含量减少(P=0.000);透射电镜和激光共聚焦显微镜结果显示自噬体和自噬溶酶体数量也增加;Western Blot结果表明虽然LC3II的表达无明显差异(P=0.865),但SQSTM1表达明显减少(P=0.000),Dynein和KIF3B的表达有所增加(P=0.000;P=0.000)。在N2a/APP695swe细胞中转染Rab7干扰RNA后,其结果与转染Rab7过表达载体相反。结论:Curcumin可以降低N2a/APP695swe细胞凋亡率、升高线粒体膜电位、减少Aβ的产生、并增强自噬体的轴突运输从而促进自噬及自噬流,其机制可能与调节Rab7的表达有关。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R749.16

【参考文献】