【摘要】：研究背景最新研究表明,70岁以上的老年人群中有严重记忆力下降的老人占10%,而一半以上是由阿尔兹海默病(Alzheimer' s Disease,AD)引起的。照料一位晚期阿尔兹海默病患者的年费用约5~6万美金,而且整个家庭及护理人员投入的精力和情感成本巨大,难以估量。阿尔兹海默病最早可以在30岁左右发病,但患病人群主要为60岁以上的老年人。患者主要表现为记忆力的逐年下降和认知功能损害的逐年加重。晚期阿尔兹海默病的典型磁共振表现为海马和中颞叶的萎缩。镜下阿尔兹海默病的典型病理表现为以β淀粉样(β-Amyloid,Aβ)蛋白为核心和主要成分的老年斑(senile plaque,SP)和以过度磷酸化的tau蛋白为主要成分的神经元纤维缠结(neurofilbrillary tangles,NFTs)以及皮层血管壁与软脑膜中的Aβ的沉积。一些致病的基因突变和某些易感性基因的发现为加快认清阿尔兹海默病发病机制的进程提供了基础。阿尔兹海默病在基因方面的主要危险因素是载脂蛋白E4(apolipoprotein ε4,Apo ε4)。携带一个载脂蛋白E4等位基因,患AD的风险将增加2~3倍;携带一对则风险增加16倍。在AD发病机制的所有学说中,形成最早、研究最成熟的是"淀粉样蛋白假说"。该假说源于对AD的基因学模型,如唐氏综合症(Down Syndrome,DS)和A β对细胞的毒性。β淀粉样蛋白是细胞正常代谢的产物,长度在36至43个氨基酸之间。Aβ40单体是淀粉样蛋白中最常见的一种,而有自身聚集倾向的Aβ42危害性最大。β淀粉样蛋白源自一种β分泌酶(β-secretase)BACE-1(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1)和一种在催化核心含有presenilin 1的γ分泌酶(γ-secretase)复合体对淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)水解的产物。β淀粉样蛋白的产生和清除的失衡及聚集造成了它在脑内的沉积,这种过量β淀粉样蛋白的沉积可能是AD的起始致病因素。BACE-2(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1)是一种BACE-1的同源蛋白,两种蛋白在结构上的相似性很高,但是对APP的酶切位点不同。BACE-2的酶切位点位于A β 42的内部,许多研究表明BACE-2可以减少细胞中A β 42的产生,所以BACE-2可以作为治疗AD的一个靶点。微小 RNA(microRNAs,miRNAs)是小非编码 RNA(small non-coding RNAs)的一种,长度多在22个核苷酸左右,在RNA介导的基因沉默中起引导作用。miRNA可以与目的mRNA的3'非翻译区(3' untranslated region,3' UTR)通过碱基互补配对结合,然后降解目的mRNA使该基因的表达水平降低。miRNA在细胞中由两种RNA聚合酶产生——Drosha和Dicer。miRNA作用广泛,涉及动物和人类生长发育和疾病发展的各个方面,绝大多数编码蛋白的mmRNA都可以为miRNA沉默。目前在人体中已经发现了 1000多种miRNA基因,而每一种miRNA能以几百至几千个不同的mRNA为目标。并且不同的miRNA相互协调地抑制彼此的表达。miRNA已经在体内组成了一个庞大、复杂而协调地基因调控网络。miRNA的生成有着严格的时间和空间调控,miRNA的生成失调与人类的许多疾病有关,例如神经退行性疾病和肿瘤。早期的研究已经表明,有些miRNA特异性地在中枢神经系统中表达,调控神经元的分化、神经突触可塑性及神经元突起的生长。多个研究通过profiling技术表明在AD患者的脑内存在miRNAs的失调。miRNA在大脑灰质中表达模式的异常可能是AD发生的因素之一。某些miRNAs对脑内A β生成过程中的关键酶有调控作用,可以减少A β在神经元中的产生。综上所述,miRNAs可能在治疗AD方面有着巨大的潜力。研究目的本研究主要探讨了在AD及其自然模型DS中miRNAs的作用,明确miRNA let-7c对BACE-2的调节作用,寻找用miRNAs治疗AD的可能性。研究方法1.研究DS与AD发展过程中miRNA表达的变化1.1.提取DS模型细胞RNA,体外反转录得到细胞的cDNA,然后用Taqman Low density array检测DS模型细胞系中miRNAs表达的变化,筛选出感兴趣的miRNA。1.2.取DS与AD模型鼠的脑,提取脑组织RNA,做针对let-7c的qPCR观察在两种脑组织中let-7c表达量的变化。2.探索let-7c对β淀粉样蛋白产生的影响2.1.培养稳转swAPP的HEK293细胞系(20E2),取培养基做ELISA检测培养基中β淀粉样蛋白的浓度;2.2.培养HEK293,分别用表达swAPP的质粒pswAPP和表达C99的质粒pC99转染后用表达let-7c的质粒pSuper-let-7c干预细胞。用ELISA检测培养基中β淀粉样蛋白酶的浓度;2.3.培养APP/PS1转基因小鼠的原代神经元,用表达let-7c的腺相关病毒感染神经元。用ELISA检测原代神经元培养基中β淀粉样蛋白的浓度;3.明确let-7c对BACE-2活性的影响3.1.提取AD细胞模型2EB2(稳转了 BACE1和swAPP)蛋白做蛋白免疫印迹实验观察let-7c作用组与对照组C99和C83/80的变化;3.2.用表达C83的质粒pC83转染HEK293,在通过RNAi抑制BACE-2和NCT的情况下,再用let-7c干预细胞,提取蛋白做免疫印迹实验,观察C83表达的变化;4.Let-7c对BACE-2转录活动的调节4.1.用let-7c干预20E2细胞,提取细胞RNA做RT-PCR和qPCR观察BACE-2表达量的变化;4.2.以pGL3-Basic为载体构建包含BACE-2启动子的质粒pB2P1,转染细胞后用let-7c干预,然后用双荧光素分析实验研究let-7c对BACE2启动子的影响;5.Let-7c在BACE-2启动子区作用位点的确定5.1.以pGL3-Basic为载体构建一系列BACE-2启动子的截短体转染细胞,然后用let-7c干预,确定let-7c在BACE-2启动子区作用位点的范围;5.2.用Blast和Jaspar软件确定let-7c在BACE-2启动子区的作用位点;6.Ago2对BACE-2表达和活性的作用6.1.用siAgo2干预2EB2的情况下,再用let-7c干预该细胞。一部分细胞提取RNA做RT-PCR观察BACE-2的表达变化;另一部分细胞提取蛋白做免疫印迹实验观察C99和C83/80在细胞中量的变化7.通过MTT实验观察let-7c对细胞增殖率的影响7.1.用let-7c干预2EB2细胞,通过MTT实验分析细胞增殖率,观察let-7c是否可以通过增加BACE-2的表达减少β淀粉样蛋白的生成,从而增加细胞增殖率;研究结果1.Taqman Low density array 检测到 DS 模型细胞中多种 miRNAs;1.1.DS模型细胞中有42种miRNA的表达与正常对照组相比发生了变化,其中let-7c是增高的;1.2.AD和DS小鼠模型脑内let-7c的表达增高;2.Let-7c降低了细胞中β淀粉样蛋白的产量;2.1.Let-7c组20E2培养基中的β淀粉样蛋白浓度低于对照组;2.2.高表达swAPP和C99的HEK293在let-7c作用下培养基中的β淀粉样蛋白的浓度低于对照组;2.3.APP/PS1转基因鼠原代神经元用pSuper-let-7c转染后可以降低培养基中β淀粉样蛋白的浓度;3.Let-7c增强了 BACE-2的作用3.1.用let-7c处理的2EB2细胞中C99的量降低,C83/80的量升高,说明let-7c可以增强BACE-2切割β淀粉样蛋白的作用;3.2.用 siBACE-2 抑制 BACE-2 后,let-7c 增加 C83/80 的作用消失;4.Let-7c增加了 BACE-2的转录4.1.RT-PCR和qPCR的结果表明let-7c可以使BACE-2的mRNA表达量增加;4.2.双荧光素酶实验中高表达let-7c组的亮度高,说明let-7c可以使BACE-2的启动子作用增强;5.在BACE-2的启动子序列中存在let-7c的反应元件5.1.通过BACE-2启动子截短体的双荧光素酶实验,我们确定了let-7c在BACE-2启动子上的作用位点存在且在-1583~-646之间;5.2.Blast分析确定let-7c的反应元件位于-1370~-1342之间;6.下调Ago2可以减少BACE-2的转录,减弱BACE-2的作用6.1.在2EB2细胞中用siAgo2抑制Ago2的作用后再用let-7c干预,RT-PCR显示BACE-2的转录减少,而且BACE-2增加细胞中C83/80量的作用也减弱甚至消失了,这说明Ago2参与了 let-7c激活BACE-2启动子的过程;7.Let-7c可以增加2EB2细胞的增殖速率;7.1.MTT实验结果为用let-7c干预的2EB2细胞的增殖要高于没有用let-7c干预的细胞,let-7c通过降低β淀粉样蛋白的产生使细胞的增殖率增加;结论1.在DS和AD的细胞和动物模型中miRNA let-7c的表达量增加;2.Let-7c可以激活BACE2基因;3.Let-7c可以减少β淀粉样蛋白的生成;
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R749.16
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本文编号：2470749
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